人臍帶間充質干細胞低氧條件培養液對小鼠造血系統自然衰老的影響*

周艷華， 許婷婷， 李 軍， 何冬梅， 譚廣銷， 劉革修

(暨南大學醫學院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

人臍帶間充質干細胞低氧條件培養液對小鼠造血系統自然衰老的影響*

周艷華， 許婷婷， 李 軍， 何冬梅， 譚廣銷， 劉革修△

(暨南大學醫學院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

目的通過探討人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)低氧條件培養液對小鼠造血系統自然衰老的延緩作用，進一步了解hUC-MSCs對機體造血的支持作用機制。方法將6月齡的BALB/c小鼠隨機分為實驗組和對照組，前者腹腔注射hUC-MSCs低氧條件培養液，每4 d 1次，持續6個月；后者注射培養基。干預后觀察小鼠一般情況，并于干預后第3個月和第6個月分別比較兩組的外周血象(白細胞與血紅蛋白)、單側股骨骨髓有核細胞(BMCN)計數、造血祖細胞集落(CFU-GM、 CFU-E、 CFU-MK)培養、成纖維細胞集落(CFU-F)培養和外源性脾集落形成單位(CFU-S)計數。于第6個月時觀察骨髓病理變化、測定比較骨髓細胞重建造血能力及P16蛋白表達情況。結果實驗組小鼠的一般情況優于對照組；干預后第3個月，實驗組的BMNC、CFU-GM和CFU-MK多于對照組，而外周血象、CFU-F和CFU-E無明顯差別；干預后第6個月，外周血象仍無顯著差別，其余的上述指標實驗組均明顯高于對照組，且各組的這些指標隨時間變化呈不斷下降的趨勢，但實驗組的下降速度明顯慢于對照組，差異顯著(P<0.05)。組織學觀察發現，實驗組造血組織較對照組豐富，P16蛋白的表達也明顯低于對照組，而對照組骨髓脂肪化顯著增加；實驗組骨髓細胞的造血重建能力明顯優于對照組。結論hUC-MSCs分泌的細胞因子能夠延緩小鼠造血系統的衰退，有望應用于延緩衰老的研究。

間充質干細胞； 臍帶； 衰老； 細胞因子類

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因具有獨特的、多樣的生物學活性而成為近年醫學研究熱點，因為具有免疫調節作用而被應用于免疫性疾病治療，因為具有多向分化潛能而被應用于再生醫學研究與應用，因為可分泌多種細胞因子和生長因子而被應用于調節組織特異細胞生物學活性研究[1，2]。然而在培養MSCs過程中換液常常將這些細胞因子、生長因子等丟棄了。這些培養液是否存在潛在價值呢？本研究采用人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)低氧條件培養液對小鼠自然衰老進行干預研究，觀察是否對造血系統有積極作用，以期為延緩造血干細胞衰老的研究開辟一條新思路。

材 料 和 方 法

1材料

足月剖宮產健康新生兒的臍帶取自暨南大學華僑醫院；6月齡雌性BALB/c純系小鼠40只、8周齡雌性BALB/c小鼠80只，SPF級，體重(20±2) g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(粵)2008-0002，所有動物實驗均按照中國科學技術委員會頒發的實驗動物管理條例執行，在無菌條件下飼養；DMEM/F12培養基、IMDM培養基、膠原酶Ⅳ和胰蛋白酶均購自Gibco；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自PAA；甲基纖維素、地塞米松、胰島素、抗壞血酸、β-磷酸甘油與油紅O購自Sigma；促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)、粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、干細胞因子(stem cell factor，SCF)和促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)均購自Peprotech；P16免疫組織化學試劑盒購自福州邁新生物技術公司。

2方法

2.1臍帶間充質干細胞的分離培養及低氧條件培養液的制備 臍帶間充質干細胞的分離培養及鑒定按文獻報道[3]的方法進行。經過鑒定的第5代細胞生長至80%融合時換不含血清的營養豐富培養液并置于37 ℃、5% O2、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h，收集培養液保存于-80°備用。

2.2hUC-MSCs低氧條件培養液干預小鼠造血系統自然衰老的觀察 隨機取8只6月齡雌性BALB/c小鼠，于干預前測定其單側股骨骨髓有核細胞計數、成纖維細胞集落、造血祖細胞集落培養、外源性脾集落形成單位計數，剩余的隨機分為實驗組和對照組，每組16 只。實驗組為hUC-MSCs低氧培養液干預組：經腹腔輸注制備好的hUC-MSCs 低氧條件培養液0.5 mL，每4 d 1次，持續輸注6個月；對照組為未干預組: 經腹腔相應地輸注0.5 mL培養基。2組動物分別于干預開始后第3個月、第6個月測定外周血象、骨髓有核細胞計數、成纖維細胞集落培養和造血祖細胞集落培養計數，并比較各組小鼠生存情況；第6月時，觀察骨髓病理變化及P16蛋白表達情況、對骨髓細胞造血重建能力進行測定比較。

2.3外周血象測定及骨髓有核細胞(bone marrow nucleated cell，BMNC)計數 實驗組和對照組分別于干預前、干預后第3個月和第6個月尾靜脈取血，常規測定其外周血白細胞(white blood cell，WBC)和血紅蛋白(hemoglobin,Hb)。于第3個月時每組各處死8只小鼠，無菌條件下取出左側股骨，按照常規方法，計數BMNC，調整細胞濃度用于祖細胞集落培養、成纖維細胞集落培養。于第6個月時處死各組剩余的8只小鼠，方法同前，計數BMNC，并進行祖細胞集落培養、成纖維細胞集落培養及骨髓細胞造血重建能力的測定，且另一側股骨用于做骨髓病理切片。

2.4造血祖細胞集落(colony-forming units-granulocyte and macrophage， CFU-GM；colony-forming units-erythroid，CFU-E；colony-forming units-megakaryocyte,CFU-MK)培養 將上述方法得到的骨髓有核細胞，接種于24孔板，細胞濃度為2×108cells/L，0.5 mL cells/well，1個復孔，分別在以下3種體系中進行培養：(1)CFU-GM培養體系：含20%的FBS、G-CSF 60 μg/L、SCF 20 μg/L和0.8%甲基纖維素的IMDM培養基；(2)CFU-E培養體系：含20%的FBS、EPO 4 kU/L、SCF 20 μg/L和0.8%甲基纖維素的IMDM培養基；(3)CFU-MK培養體系：含20%的FBS、TPO 60 μg/L、SCF 20 μg/L和0.8%甲基纖維素的IMDM培養基。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中孵育，3 d后計數CFU-E集落數，大于8個細胞計數為1個集落；7 d后計數CFU-GM集落數，大于50個細胞計數為1個集落；14 d 后計數CFU-MK集落數，大于3個細胞計數為1個集落。

2.5成纖維細胞集落形成單位( fibroblast colony-forming units，CFU-F)培養 建立CFU-F培養體系[4]，再加入已制備好的骨髓細胞懸液，以5×104cells/cm2的密度接種于6孔板，置于37 ℃、7% CO2、飽和濕度培養箱中培養，每3 d換液1次，第14 d在倒置顯微境下計數大于30個細胞的集落。

2.6外源性脾集落形成單位(exogenous spleen colony-forming units，CFU-S)計數 CFU-S計數反映供體小鼠骨髓細胞居留在受體小鼠脾臟造血組織中的干細胞數量。受體為8周齡雌性BALB/c小鼠，在接受致死量[60Coγ](8 GY)照射后4 h左右，由尾靜脈注射上述過程中得到的骨髓有核細胞各0.2 mL(含2×106cells)。2周后，斷頸處死小鼠取出脾臟，浸在Bouin液中24 h，80%乙醇中脫色3 d(每天換液1次)，然后進行CFU-S 計數。

2.7骨髓病理變化及P16蛋白表達測定 在上述過程中得到的股骨快速放入體積分數為4%鹽酸甲醛脫鈣固定液中，12 h后進行常規脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片，HE染色后在顯微鏡下觀察骨髓造血組織情況并攝像。骨髓組織的衰老程度觀察通過檢測其P16蛋白的表達情況，采用免疫組織化學染色檢測，操作步驟按試劑盒說明進行，DAB顯色，封片后并攝像。

2.8骨髓細胞的造血重建能力測定 干預后第6個月，進行骨髓移植實驗，受體為8周齡雌性BALB/c小鼠，40只，分為5 組(8只/組)；供體為上述得到的骨髓有核細胞以及另外制備的年輕小鼠的骨髓細胞。受體小鼠在接受致死量[60Coγ](8 GY)照射后4 h內進行移植。(1)Ⅰ組：供體小鼠為經hUC-MSCs培養液干預后的小鼠，受體接受照射后，輸注細胞0.1 mL(含5×106cells)；(2)Ⅱ組：供體小鼠為未經hUC-MSCs培養液干預的小鼠，受體接受照射后，輸注細胞0.1 mL(含5×106cells)；(3)Ⅲ組：供體為年輕的8周齡小鼠，受體接受照射后，輸注細胞0.1 mL(含5 ×106cells)；(4)Ⅳ組：單純照射組，受體接受照射后，輸注IMDM 0.1 mL；(5)Ⅴ組：空白對照組，不接受照射，僅輸注IMDM 0.1 mL。移植后，小鼠每天飲慶大霉素酸化水(4×105U/L)。觀察各組小鼠一般情況更及存活狀態；各組分別在照射前(+0 d)及照射后+7 d、+14 d、+21 d、+28 d測定小鼠外周血WBC及Hb變化，并進行各組生存率比較。

3統計學處理

結 果

1小鼠MSCs輸注實驗中一般情況觀察

對照組小鼠在觀察期內(6-12月齡)出現毛發粗糙無光澤，脫毛較多，體重減輕，運動逐漸遲緩，精神狀態較差；而實驗組小鼠在觀察期內毛發保持光亮，較少脫毛，體重保持穩定，運動能力及精神狀態改變不明顯。

2hUC-MSCs低氧條件培養液輸注對小鼠造血系統的影響

經測定比較兩組小鼠外周血象，無顯著差異，隨著時間的變化也未出現顯著波動,見表1。但是其余指標變化明顯，干預后第3個月測定，實驗組的BMNC、CFU-GM、CFU-MK計數均高于對照組(P<0.05)，而CFU-F、CFU-E、CFU-S計數無顯著差異；第6個月測定實驗組的指標均明顯高于對照組(P<0.05)。隨時間變化各組指標變化呈不同的趨勢，實驗組下降速度明顯慢于對照組，差異顯著(P<0.05),見表2。

3hUC-MSCs低氧條件培養液輸注對小鼠骨髓病理變化及P16蛋白的影響

骨髓切片顯示，實驗組有核細胞較多，造血組織明顯多于對照組；而對照組脂肪組織明顯多于實驗組,見圖1A-C。P16蛋白與造血組織衰老程度密切相關，大都表達在細胞漿中，經免疫組化染色后，陽性細胞呈棕黃色，實驗組P16蛋白表達量明顯低于對照組，但高于年輕的8周齡小鼠，見圖2A-C。

表1hUC-MSCs條件培養液干預對小鼠外周血象的影響

ExperimentalgroupControlgroupWBCHbWBCHbBeforeintervention9．73±3．08103．90±15．959．26±1．73100．46±2．073rdmonth9．50±1．13109．34±13．658．99±1．91104．72±14．076thmonth9．74±2．67114．85±18．989．59±2．49105．48±3．37

表2hUC-MSCs條件培養液對小鼠BMNC計數、造血祖細胞集落生長、CFU-F和CFU-S的影響

ExperimentalgroupControlgroupBeforeintervention3rdmonth6thmonthBeforeintervention3rdmonth6thmonthBMNC9．9±2．210．0±1．2▲9．5±0．8◆10．5±1．98．9±1．37．9±0．8CFU-GM37．0±8．835．2±6．6##31．7±8．6??36．5±7．827．5±8．421．4±9．6CFU-E29．9±6．125．9±7．925．7±6．9??31．9±5．825．4±7．019．1±6．1CFU-MK54．5±11．557．8±12．4▲52．5±11．6??53．4±10．549．8±12．241．2±9．1CFU-S44．3±9．342．5±10．842．5±4．9??45．1±10．340．6±11．133．7±8．4CFU-F63．4±12．756．8±12．050．1±11．0??61．9±11．952．1±11．740．6±8．9

▲P<0.05vscontrol group at 3rd month；##P<0.01vscontrol group at 3rd month；◆P<0.05vscontrol group at 6th months；**P<0.01vscontrol group at 6th months.The change trends were different with time，P<0.05.

Figure 1. Histological observation of mouse bone marrow (HE staining，×100). A：the bone marrow biopsy of young mice,with very rich hematopoietic tissue and almost invisible adipose tissue；B：the bone marrow biopsy of control group, less hematopoietic tissue was observed and much more adipose tissue was filled in almost the whole marrow cavity；C：the bone marrow biopsy of experimental group, more hematopoietic tissue and less adipose tissue were found compared with that of control group.

圖1小鼠骨髓組織學觀察

Figure 2. The expression of P16 protein in mouse bone marrow(×200). A：young mice；B：conrtrol group；C：experimental group；D：negative control.

圖2骨髓P16蛋白的表達量

4hUC-MSCs低氧條件培養液輸注后的供體對小鼠骨髓細胞造血重建能力的影響

不同時點WBC、Hb量及其兩者動態變化的比較可以反映不同供體骨髓重建造血的能力。移植后1-2周為小鼠骨髓抑制的嚴重期，Ⅳ組小鼠死亡時間為第+6 d-第+14 d，主要死于造血衰竭。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各組的指標隨時間恢復的趨勢不同(P<0.01)，Ⅲ組WBC與Hb恢復最快，Ⅱ組恢復最慢，Ⅰ組介于兩者之間，見表3、4。Ⅳ組生存率為0，Ⅲ組與Ⅴ組的小鼠全部存活，Ⅰ、Ⅱ組均有小鼠死亡，但Ⅰ組生存率(88.5%)高于Ⅱ組(63.5%)。

表3 各組小鼠不同時點外周血WBC的變化

▲▲P<0.01vsⅡ group；##P<0.01vsⅢ group；○P<0.05vsⅣ group；●●P<0.01vsⅣ group；**P<0.01vsⅤ group.

表4 各組小鼠不同時點外周血Hb的變化

▲▲P<0.01vsⅡ group；○○P<0.01vsⅢ group；#P<0.05vsⅢ group；●●P<0.01vsⅣ group；**P<0.01vsⅤ group.

討 論

衰老(aging or senescence)是機體的細胞、組織與器官在結構和功能上逐漸出現不可逆轉地、全面地退化，其關鍵在于組織特異干細胞衰老、再生能力下降。造血系統作為人體重要的系統之一，隨著年齡的增長會出現功能不斷衰退。造血系統的核心是造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，通過增殖與發育分化以持續補充機體各種血細胞需要；而骨髓MSCs則與基質等組成造血微環境，支持調節HSCs生物學活性。造血系統漸進的衰老表現為造血細胞的產生及造血微環境穩態調控能力的下降[4,5]，其最終結果是造血功能衰退、不能滿足機體需要。HSCs衰老表現為自我復制與增殖能力下降，導致骨髓中造血干/祖細胞數量減少；MSCs衰老則表現為分泌重要細胞因子和生長因子的能力下降、對HSCs調節支持作用下降，而且向脂肪細胞分化、抑制造血[6]。那么，有什么措施延緩造血系統衰老、調整機體健康狀態？

幾十年國內外骨髓移植結果顯示，HSCs具有極強的免疫原性和免疫力、可產生移植排斥反應；而且進行骨髓移植難度極大。所以，直接運用年輕HSCs取代機體內衰老HSCs具有極大難度，很難被應用于抗衰老。既然衰老MSCs分泌重要細胞因子和生長因子的能力下降、對HSCs調節支持作用下降，那么，是否可以通過補充相應重要細胞因子和生長因子以增強對HSCs支持作用呢？本研究給中老年老鼠定期輸注間充質干細胞低氧條件培養液，結果發現這不僅可改善其一般情況，還可以調節骨髓造血干/祖細胞數量與質量以及骨髓造血微環境：實驗組小鼠骨髓造血祖細胞集落數、外源性脾集落形成單位數、造血重建能力和CFU-F數均顯著高于同期對照組小鼠；組織學觀察顯示實驗組造血組織比同期對照組豐富、脂肪化輕，而且未經MSCs低氧條件培養液干預的小鼠骨髓P16蛋白表達量明顯高于干預小鼠。P16蛋白是抑癌基因P16編碼，是細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子，是細胞衰老的重要指標，通過阻止pRb蛋白磷酸化，進而抑制從G1期進入S期所需的下游基因的表達，將細胞周期阻斷在G1期、細胞則逐漸衰老；抑制P16，細胞周期蛋白依賴激酶活性增加，pRb磷酸化失活，轉錄因子EZF活性增高，多種生命必需基因得以表達，DNA修復能力增強，端粒縮短減慢，從而延緩細胞衰老[7,8]。所以，本研究結果說明hUC-MSCs低氧條件培養液干預可延緩小鼠造血系統自然衰老。由于hUC-MSCs可被干擾素-γ激活而提高MHCⅠ類分子的表達水平并表達MHCⅡ類分子，如將其多次注射于炎癥區域或注射前應用干擾素-γ則能誘發免疫反應[9]，因此，與直接應用hUC-MSCs本身相比，其條件培養液在臨床應用方面可能具有其優點，如在不能直接應用hUC-MSCs時選擇其條件培養液。

hUC-MSCs低氧條件培養液為什么具有這些作用呢？研究顯示，hUC-MSCs 不僅具有極強的增殖和分化能力[10,11]，表達原始干細胞標志，如白血病抑制因子受體通路、胚胎干細胞特異基因Ⅰ、Nanog、Oct-4等[12,13]，具有干細胞特性；而且能分泌多種細胞因子,如白細胞介素-6、單核細胞趨化蛋白-1、生長相關癌基因、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子結合蛋白4和白細胞介素-8等[14]，支持CD34+臍帶血HSCs擴增[15]；支持ESCs發育分化[16]。這些資料說明hUC-MSCs具有極強的生物學活性，可產生重要因子發揮支持調節作用。最近研究發現干細胞在低氧環境中具有更好的生物學活性。MSCs培養在低氧環境中不僅增殖更快，而且干細胞標志性基因表達水平更高，端粒逆轉錄酶的活性增加[17，18]。利用人體皮膚細胞培養iPS細胞時把培養環境的氧濃度從通常的21%降到5%，iPS細胞的生成效率可提高到原來的2.5-4.2倍[19]。劉革修等[20-23]研究發現MSCs在低氧環境中多種生長因子表達增高。所以，推測hUC-MSCs低氧條件培養液延緩小鼠造血系統自然衰老作用可能與hUC-MSCs在低氧條件下分泌重要細胞因子和生長因子有關。其詳細情況有待進一步研究。

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Effectsofhypoxic-conditionedmediumofmesenchymalstemcellsfromhumanumbilicalcordonnaturalsenescenceofmousehematopoieticsystem

ZHOU Yan-hua, XU Ting-ting, LI Jun, HE Dong-mei, TAN Guang-xiao, LIU Ge-xiu

(InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliugx@jnu.edu.cn)

AIM: To explore the anti-aging roles of hypoxic-conditioned medium of mesenchymal stem cells from human umbilical cord (hUC-MSCs) on the natural senescence of hematopoietic system in aging mice.METHODSThe 6-month-old BALB/c mice were randomly divided into experimental group and control group. The mice in experimental group were intraperitoneally injected with hypoxic-conditioned medium of hUC-MSCs every 4 days for 6 months, and the mice in control group were injected with medium. After treated with hypoxic-conditioned medium of hUC-MSCs, the general situations of the mice were observed. Three months and 6 months after treatment, peripheral hemogram(white blood cell and hemoglobin), bone marrow nucleated cell (BMNC)count, hematopoietic progenitor cell colony (CFU-GM, CFU-E, CFU-MK)culture, fibroblast colony (CFU-F)culture, and exogenous spleen colony-forming unit (CFU-S)count were compared between the 2 groups. Bone marrow histology, P16 expression, and the capability of hematopoietic reconstruction of the bone marrow cells were also compared at the sixth month.RESULTSThe general status of the mice in experimental group was better than that in control group. At the third month, BMNC, CFU-GM and CFU-MK of the experimental group were higher than those in control group. No significant difference of the peripheral hemogram, CFU-F, CFU-E and CFU-S was observed. At the sixth month, all the indexes mentioned above in experimental group were higher than those in control group except peripheral hemogram. All the indexes had a similar descending-tendency during 6 months, but the tendency of experimental group was much slower than that of control group with significant difference (P<0.05). In experimental group, more hematopoietic tissue and less adipose tissue were observed, and the expression level of P16 was lower than those in control group. The hematopoietic reconstruction capability of bone marrow cells in experimental group was better than that in control group.CONCLUSIONThe cytokines from hUC-MSCs slow down the natural recession of hematopoietic system in aging mice, which may be considered to be a potential strategy of anti-aging research in the future.

Mesenchymal stem cells; Umbilical cord; Aging; Cytokines

R322

A

1000-4718(2011)03-0469-06

2010-10-08

2011-01-13

國家自然科學基金資助項目(No. 30670902)

△通訊作者 Tel：020-85220262；E-mail: tliugx@jnu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.010