白花丹醌增強TRAIL誘導Kasumi-1細胞凋亡及其機制*

徐同鵬, 劉立根,2△, 蔣雪瑋, 高 武, 謝英華, 趙莉敏, 韓曦瑤, 陸道培,2

(1復旦大學附屬上海市第五人民醫院血液科，復旦大學血液病研究中心,上海 200240； 2上海道培醫院, 上海 200240)

白花丹醌增強TRAIL誘導Kasumi-1細胞凋亡及其機制*

徐同鵬1, 劉立根1,2△, 蔣雪瑋1, 高 武1, 謝英華1, 趙莉敏1, 韓曦瑤1, 陸道培1,2

(1復旦大學附屬上海市第五人民醫院血液科，復旦大學血液病研究中心,上海 200240；2上海道培醫院, 上海 200240)

目的觀察白花丹醌、rsTRAIL單獨及其聯合體外誘導Kasumi-1細胞凋亡的作用，探討其作用機制。方法采用WST-8 (CCK-8)比色法測定rsTRAIL、白花丹醌單獨和聯合應用對Kasumi-1細胞的生長抑制率；用流式細胞術、TUNEL法觀察并且檢測凋亡率；實時定量PCR檢測白花丹醌作用后DR4和DR5 mRNA水平變化；Western blotting法檢測單獨應用及聯合應用后DR5、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bid、Bax及c-FLIP的變化。結果(1)白花丹醌和rsTRAIL單獨應用均可抑制Kasumi-1細胞的生長，聯合應用可增加對Kasumi-1細胞的生長抑制率且呈時間和劑量依賴性(P<0.05)。(2)rsTRAIL(100 μg/L)和白花丹醌(2 μmol/L)單用及其聯合使用誘導Kasumi-1細胞Annexin V陽性細胞百分率分別為(27.7±2.9)%、(25.6±3.1)%和(52.1±3.3)%。(3)TUNEL法檢測發現聯合應用組較單用組凋亡細胞顯著增多。(4)實時定量PCR檢測發現白花丹醌可以上調DR5的表達。(5)Western blotting發現白花丹醌單獨作用及其聯合rsTRAIL應用時上調DR5、激活caspase-8和下調c-FLIP表達。結論白花丹醌具有增強TRAIL誘導Kasumi-1細胞凋亡的作用，其機制與DR5上調、caspase-8激活和c-FLIP下調有關。

Kasumi-1細胞； 細胞凋亡； 白花丹醌； 腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體; 基因,DR5; 基因,DR4

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是TNF超家族成員之一，是一種Ⅱ型膜蛋白，通過與其特異性死亡受體(DR4和DR5)結合而激活凋亡信號轉導途徑，從而誘導腫瘤細胞凋亡[1]。白花丹醌是中藥白花丹的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，包括抗菌消炎、抗生殖、抗凝等作用[2,3]。研究發現，白花丹醌也具有明顯的抗腫瘤作用，能夠抑制K562、Raji、Jurkat、NB4等白血病細胞系以及宮頸癌和肝癌等實體瘤細胞系的生長和增殖[3-5]。Kasumi-1是培養自人t(8;21)急性髓系白血病患者的細胞系，為體外研究該類型白血病的良好模型。盡管伴t(8;21)急性髓系白血病患者相對預后良好，復發和耐藥仍然是威脅患者長期生存的主要問題。本研究旨在探討TRAIL及其聯合白花丹醌體外誘導Kasumi-1細胞凋亡的作用，為此類患者的治療尋找新的治療方法。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞系與主要試劑 Kasumi-1細胞由中國協和醫科大學天津血研所王建祥教授饋贈，用含20%胎牛血清的RPMI-1640培養液在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下的孵育箱中培養，取對數生長期的細胞進行實驗。白花丹醌購自Sigma，溶解于二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中，配成0.1mol/L儲備溶液，置于4 ℃保存，使用時應用RPMI-1640培養液稀釋至工作濃度(工作液中DMSO終濃度均小于0.1%，預實驗證實對Kasumi-1細胞無影響)。人重組可溶性三聚體TRAIL(rsTRAIL)由上海恰爾生物技術有限公司饋贈。CCK-8試劑購自日本同仁化學，AnnexinⅤ/PI試劑盒購自南京凱基生物，TUNEL試劑盒購自羅氏公司。胎牛血清購自Gibco，逆轉錄試劑盒購自Fermentas，SYBR Green PCR Master Mix 購自BD。兔多抗anti-DR5和anti-Bid購自Abcam,鼠單抗anti-caspase-3、anti-caspase-8、anti-caspase-9、anti-Bcl-2和anti-Bax購自RD,anti-GAPDH購自Cell Signaling,鼠單抗anti-cFLIP購自Stressgen。 HRP標記的山羊抗兔和山羊抗鼠Ⅱ抗購自Chemicon。

1.2培養細胞分組 將Kasumi-1細胞按照5×108cells/L的濃度接種到96孔板，分為4組：rsTRAIL組(10、25、50、100、250、500、1 000 μg/L,作用12 h、24 h、48 h、72 h)、白花丹醌組(2、4、6、8、10、12 μmol /L,作用12 h、24 h、48 h)、聯合用藥組(在加入不同濃度rsTRAIL的同時分別加入2 μmol/L和4 μmol/L的白花丹醌作用12 h、24 h)和空白對照組(不加任何藥物)。

2方法

2.1Wright染色觀察細胞形態學變化 取不同藥物處理組的細胞，甩片固定后滴加瑞氏染液染1 min，加等量pH 6.4的磷酸鹽緩沖液輕輕晃動玻片,均勻靜置5 min，顯微鏡下觀察形態變化。

2.2CCK-8比色法檢測細胞抑制率 將細胞懸液以RPMI-1640培養液洗滌并調整細胞密度至5×108cells/L，加入96孔培養板中，每孔200 μL。分別以不同的藥物劑量作為1組，每組均設3個復孔及1個對照孔，對照孔加入空白對照組的細胞。藥物作用12、24、48、72 h后，每孔加入CCK-8 20 μL，溫箱中繼續孵育3 h后選擇450 nm波長測定各孔的吸光度(A)值。以該組復孔的平均值作為該組細胞的A值，并計算細胞生存率:細胞生存率(%)=(實驗A-空白A)/A(對照A-空白A)×100%，實驗重復5次。

2.3Annexin V/PI雙染色檢測細胞凋亡率 不同藥物劑量作用細胞12 h后，分別取1×106個不同用藥組細胞用PBS洗滌2次，加入FITC標記Annexin V和PI(操作按說明書進行)，避光放置1 h，流式細胞儀(FACS Caliber，BD)檢測，Cell Quest軟件進行數據分析。Annexin V陽性且PI陰性的細胞為早期凋亡細胞，Annexin V和PI均為陽性的細胞為晚期凋亡細胞，二者合并計算細胞凋亡率，實驗重復5次。

2.4TUNEL法檢測細胞凋亡 收集不同濃度rsTRAIL(25、50、100 μg/L)單獨作用、不同濃度rsTRAIL(25、50、100 μg/L)聯合2 μmol/L和4 μmol/L白花丹醌作用12 h的各組細胞，甩片固定后脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)法檢測細胞凋亡，按照說明書步驟操作。結果判定：四唑氮藍(NBT)顯色，凋亡細胞核被染成深褐色，非凋亡細胞呈藍色。每組濃度取3個獨立實驗標本，每張切片隨機計數200個細胞，根據TUNEL陽性細胞計算細胞凋亡。

2.5實時定量PCR檢測基因變化 2 μmol/L和4 μmol/L白花丹醌作用Kasumi-1細胞8 h和12 h后，用Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA(按照試劑盒操作說明)。合成cDNA第1鏈后進行real-time PCR。反應條件如下：SYBR Green Mix(2×)10 μL,上游引物0.25 μL，下游引物0.25 μL，DEPC水7.5 μL，cDNA模板2 μL。上述20 μL體系95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。引物序列：DR4正義鏈5’-GGCTGAGGACAATGCTCACA-3’, 反義鏈5’-TTGCTGCTCAGAGACGAAAGTG-3’;DR5正義鏈5’-CCAGCCCTCCCTCAGATGTAC-3’, 反義鏈5’-TGTAAGGTTGTCCAGTTCAAAAGACT-3’;β-actin正義鏈5’-CCAGCTCACCATGGATGATG-3’,反義鏈5’-ATGCCGGAGCCGTTGTC- 3’。

數據分析：DR4和DR5 mRNA半定量用2-△△ct來表示(△Ct為目的基因Ct值減去β-actin的Ct值,△△Ct為用藥組的△Ct值減去對照組的△Ct值)。實驗重復3次，取其平均值半定量最后的表達水平。

2.6Western blotting檢測細胞系凋亡相關蛋白的表達 2 μmol/L和4 μmol/L白花丹醌分別單獨作用Kasumi-1細胞8 h和12 h，100 μg/L rsTRAIL單獨作用Kasumi-1細胞12 h，2 μmol/L白花丹醌聯合100 μg/L rsTRAIL作用12 h后，收集不同處理組細胞標本，制備細胞總蛋白，用BCA法測蛋白濃度，每組樣品均取30 μg總蛋白上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗4 ℃過夜，然后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，加入ECL顯影液，暗室顯影。

3統計學處理

結 果

1Wrigh染色后顯微鏡下形態

普通光學顯微鏡下觀察不同藥物處理后細胞形態學改變。單用rsTRAIL(100 μg/L)、單用白花丹醌2 μmol/L和聯合rsTRAIL(100 μg/L)+白花丹醌2 μmol/L作用12 h后觀察發現，單用和聯合用藥組細胞形態均出現胞體縮小和胞核固縮等顯著變化，但聯合用藥組改變更為顯著,見圖1。

Figure 1. Cell death induced by rsTRAIL, plumbagin or combination of plumbagin with rsTRAIL for 12 h.Morphological aspect of Kasumi-1 cells were analyzed by Wrighting staining (×100).A:control;B:plumbagin(2 μmol/L);C:rsTRAIL(100 μg/L);D:combination of plumbagin with rsTRAIL.

圖1白花丹醌、rsTRAIL單用和聯合用藥對Kasumi-1細胞作用的形態學觀察

2細胞生長抑制實驗結果

不同濃度的白花丹醌和rsTRAIL單用對Kasumi-1細胞均有抑制生長作用，但是聯合2 μmol/L或4 μmol/L白花丹醌后，rsTRAIL對細胞的生長抑制作用更為顯著，見圖2。

3流式細胞術(AnnexinV/PI雙染色)檢測凋亡率

收集白花丹醌(2 μmol/L)、rsTRAIL(100 μg/L)單獨和聯合用藥作用12 h后的Kasumi-1細胞，用AnnexinV FITC/PI 雙標記檢測細胞凋亡率。結果發現，rsTRAIL聯合白花丹醌作用Kasumi-1細胞12 h，與相同質量濃度rsTRAIL和相同質量濃度的白花丹醌分別單獨作用Kasumi-1細胞12 h相比，能明顯增加細胞凋亡率，前者Annexin V - FITC 陽性率水平為(52.1±3.3)%, 后兩者分別為(27.7±2.9)% 和(25.6±3.1)%,差異顯著(P<0.01),見表1、圖3。

4TUNEL法檢測細胞凋亡

白花丹醌與rsTRAIL聯合作用12 h后即可檢測到較多Kasumi-1細胞凋亡，凋亡細胞染成深褐色，非凋亡細胞呈藍色。各組細胞凋亡率的比較見圖4，不同濃度rsTRAIL可誘導Kasumi-1細胞發生凋亡，而聯合2 μmol/L或4 μmol/L白花丹醌后，平均凋亡率均高于單用rsTRAIL組，表明白花丹醌能夠顯著增強rsTRAIL誘導的Kasumi-1細胞凋亡效應。

5實時定量PCR法檢測Kasumi-1細胞DR5和DR4mRNA水平變化

2 μmol/L和4 μmol/L白花丹醌作用Kasumi-1細胞8 h和12 h后，與空白對照組比較，DR5 mRNA表達顯著增加，而DR4 mRNA水平增加不明顯，與空白對照組比較無顯著差異，見圖5(以上數據取自3次獨立實驗的平均值)。因此，白花丹醌作用后可以上調DR5的mRNA水平，但對DR4 mRNA水平無明顯影響。

Figure 2. Effects of plumbagin,rsTRAIL and combination of rsTRAIL with plumbagin on growth inhibition of Kasumi-1 cells.A: effects of various concentrations (10 -1 000 μg/L) of rsTRAIL on cell viability at 12 h,24 h,48 h or 72 h;B: effects of different concentrations (2 - 12 μmol/L) of plumbagin on cell viability at 12 h, 24 h or 48 h;C: effects of rsTRAIL combined with 2 μmol/L or 4 μmol/L plumbagin on cell viability at 24 h.*P<0.05vscontrol(0);△P<0.05vsrsTRAIL alone group.P2+rsTRAIL: the combination of 2 μmol/L plumbagin with various concentrations of rsTRAIL; P4+rsTRAIL: the combination of 4 μmol/L plumbagin with various concentrations of rsTRAIL.

圖2rsTRAIL、白花丹醌單用和兩者聯用對Kasumi-1細胞的生長抑制作用

表1白花丹醌(2μmol/L)、rsTRAIL(100μg/L)單獨和聯合用藥12h后Kasumi-1細胞AnnexinV的陽性率

GroupAnnexinV-positiverate(%)Control7．3±2．1Plumbagin25．6±3．1??rsTRAIL27．7±2．9??plumbagin-rsTRAIL52．1±3．3△△

**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsplumbagin or rsTRAIL.

6白花丹醌單獨及聯合rsTRAIL對Kasumi-1細胞DR5蛋白的影響

以未加藥物的Kasumi-1細胞為對照組，經2 μmol/L和4 μmol/L白花丹醌分別處理8 h和12 h后，DR5的表達量明顯增加，并與白花丹醌作用時間和濃度呈正相關,見圖6A,經2 μmol/L白花丹醌和100 μg/L rsTRAIL聯合作用Kasumi-1細胞 12 h后，DR5的表達量也明顯增加,見圖6B,說明白花丹醌單獨及聯合rsTRAIL均可以上調Kasumi-1細胞DR5蛋白的表達。

7白花丹醌聯合rsTRAIL對Kasumi-1細胞相關凋亡蛋白的影響

以未加藥物的Kasumi-1細胞為空白對照組，以2 μmol/L白花丹醌、100 μg/L rsTRAIL單獨作用12 h的細胞作為陰性對照，經2 μmol/L白花丹醌和100 μg/L rsTRAIL聯合作用12 h后，細胞相關凋亡蛋白caspase-3、-8、-9和Bid較對照組明顯激活，白花丹醌單獨作用組及聯合用藥組Bax蛋白表達量增加、c-FLIP蛋白表達量減少,見圖7，表2，提示聯合用藥可以激活caspase-3、-8、-9和Bid，并且上調促凋亡蛋白Bax和下調抑制凋亡蛋白c-FLIP的表達。

討 論

t(8；21)陽性急性髓系白血病約占急性白血病患者的10%-15%，被認為是預后良好的一種類型。國外報道其長期生存率為60%-70%[6],國內兩個較大系列的研究報告5年總生存率僅為39%和50%，難治或復發仍然是患者治療失敗的主要原因。因此，尋找新的治療藥物對提高此類患者完全緩解率乃至長期生存具有重要的臨床價值。

TRAIL是腫瘤壞死因子超家族成員，具有誘導腫瘤細胞或/和轉化細胞凋亡而不損傷正常細胞的作用，是該家族中唯一被認為有望應用于臨床的抗腫瘤藥物。臨床前研究中發現，它對人白血病有較強的殺傷作用而對宿主細胞幾乎無毒性[7],但是耐藥限制了其臨床應用[8]。白花丹醌具有良好的殺傷腫瘤細胞的作用，通過線粒體途徑誘導腫瘤細胞的凋亡，但大劑量使用時具有較強的細胞毒作用[13]。 Kasumi-1是一種經典的t(8;21)陽性急性髓系白血病細胞株，目前尚未見有關TRAIL和/或白花丹醌對Kasumi-1細胞作用的報道。

Figure 3. Co-treatment of rsTRAIL and plumbagin resulted in a striking increase in apoptosis of Kasumi-1 cells. The percentage of apoptotic cells was determined by Annexin V/PI staining. A:control; B: 2 μmol/L plumbagin; C:100 μg/L rsTRAIL;D: combination of 2 μmol/L plumbagin with 100 μg/L rsTRAIL.

圖3流式細胞術測定TRAIL、白花丹醌單用和聯合對Kasumi-1細胞AnnexinV/PI表達的作用

Figure 4. Co-treatment of rsTRAIL and plumbagin resulted in a striking increase in apoptosis of Kasumi-1 cells. After indicated treatment for 12 h, the cells were TdT-UTP nick end-labelled and imaged by light microscopy(×400). The content of TUNEL-positive cells was the number of brown precipitate in each photograph.TUNEL-positive cells were apoptotic cells of early stage.*P<0.05vsrsTRAIL alone group.

圖4TUNEL法測定TRAIL、白花丹醌和聯合對Kasumi-1細胞凋亡的作用

本研究發現rsTRAIL體外單獨應用可以誘導Kasumi-1細胞的凋亡，但是單獨應用濃度500 μg/L以上的rsTRAIL其細胞凋亡率維持在70%左右，不再出現顯著增加，提示存在TRAIL耐藥可能。白花丹醌單獨應用可以劑量依賴性誘導Kasumi-1細胞凋亡，2 μmol/L以下低濃度則誘導細胞凋亡顯著減弱。2 μmol/L和4 μmol/L白花丹醌聯合50-500 μg/L rsTRAIL可以劑量和時間依賴性誘導Kasumi-1細胞凋亡，提示白花丹醌能夠增強TRAIL誘導的白血病細胞株Kasumi-1凋亡。

Figure 5. Analysis of DR4 and DR5 based on mRNA levels from Kasumi-1 cells 8 h,12 h after treatment with 2 μmol/L and 4 μmol/L of plumbagin. Results were reported as average fold induction relative to the untreated sample. All detection values were normalized according to the β-actin internal control.*P<0.05vscontrol group.

圖5白花丹醌對Kasumi-1細胞DR5、DR4mRNA表達的影響

TRAIL凋亡途徑是外源性誘導細胞凋亡通路，細胞死亡受體DR4和DR5的表達、caspases激活、Bcl-2家族蛋白等多種因素參與該通路的激活。

表2白花丹醌(2μmol/L)、rsTRAIL(100μg/L)單獨和聯合用藥12h后Kasumi-1細胞凋亡相關蛋白的相對表達量

GroupCleavedcaspase-8Cleavedcaspase-3Pro-caspase-9BidBaxcFLIPControl0．20±0．020．10±0．010．80±0．020．80±0．020．10±0．010．70±0．02Plumbagin0．40±0．02?0．30±0．02?0．40±0．02?0．90±0．010．60±0．02?0．40±0．02?rsTRAIL0．50±0．02?0．30±0．03?0．70±0．030．60±0．02?0．10±0．010．70±0．03Plumbagin+rsTRAIL0．80±0．02??▲0．50±0．04??▲0．30±0．01??▲0．30±0．02??▲0．70±0．03??0．30±0．02??

All the values were normalized acconding to the GAPDH internal control.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;▲P<0.05vsplumbagin or rsTRAIL.

圖6白花丹醌單獨及聯合rsTRAIL對Kasumi-1細胞DR5蛋白表達的影響

Figure 7. Western blotting for caspase-3, caspase-8, caspase-9, Bid, Bax, and cFLIP. Kasumi-1 cells were treated with plumbagin (2 μmol/L)alone, rsTRAIL (100 μg/L) alone or with both agents for 12 h.

圖7白花丹醌單獨及聯合rsTRAIL對Kasumi-1細胞凋亡相關蛋白表達的影響

TRAIL耐藥涉及細胞表面死亡受體和誘騙受體的表達、c-FLIP表達以及凋亡蛋白抑制因子(IAP)表達等[8]。有研究發現DR5蛋白差異表達可作為評價腫瘤細胞對TRAIL敏感程度的觀察指標之一，某些抗腫瘤藥物可以通過上調DR5的表達而發揮和TRAIL的協同作用[9-12]。本研究結果表明，白花丹醌可以上調Kasumi-1細胞DR5的表達，提示增加DR5的表達是白花丹醌增強Kasumi-1細胞TRAIL的敏感性機制之一。

白花丹醌屬于蒽醌類藥物，其醌核具有較強的親電子作用，通過與還原性谷胱甘肽作用降低細胞清除氧自由基的能力，從而激活活性氧依賴的細胞內源性途徑誘導的細胞凋亡[4，13]。本研究發現，單用白花丹醌可以激活Bax和caspase-9，提示內源性通路是其誘導細胞凋亡的主要途徑。Caspase-8是外源性凋亡途徑中非常重要的信號蛋白，非常有趣的是，本研究發現白花丹醌可以顯著激活caspase-8，與Xu等[13]發現白花丹醌誘導NB4細胞凋亡時caspase-8激活一致。已有研究[14]發現，表阿霉素等依賴內源性凋亡通路的抗腫瘤藥物可以通過caspase-3激活caspase-8且不依賴Fas，提示外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑之間存在交叉通路。因此，我們推測激活casapse-8這一重要的細胞外源性凋亡通路信號蛋白與白花丹醌增強TRAIL誘導的Kasumi-1細胞凋亡有關。

c-FLIP通過其N端的2個DED競爭性結合FADD和/或caspase-8/l0，阻斷外源性凋亡通路中caspase-8/10的活化，使caspases級聯反應不能繼續，從而阻斷外源性凋亡信號轉導，起到抑制凋亡的作用，是TRAIL耐藥的重要機制[15]。 本研究發現單獨應用低濃度白花丹醌(2 μmol/L)可以顯著下調c-FLIP的表達，與rsTRAIL聯合應用時其下調c-FLIP作用仍然存在，提示白花丹醌下調c-FLIP表達也是其增強TRAIL誘導Kasumi-1細胞凋亡的機制之一。

綜上所述，白花丹醌通過多種機制增強TRAIL誘導Kasumi-1細胞凋亡，具有潛在逆轉TRAIL耐藥的作用，有望為難治/復發t(8;21)急性髓系白血病的治療找到一條新的途徑，但尚需更深入的實驗和臨床研究。

[1] Wiley SR，Schooley K，Smolak PJ，et al．Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis[J]．Immunity，1995，3(6)：673-682．

[2] 郭曉莊．有毒中草藥大辭典[M]．第1版．天津：天津科技翻譯出版公司,1992．177-179.

[3] Lin LC，Yang LL，Chou CJ. Cytotoxic naphthoquinones and plumbagic acid glucosides fromPlumbagozeylanica[J]．Phytochemistry，2003，62(4)：619-622.

[4] Srinivas P, Gopinath G, Banerji A，et al. Plumbagin induces reactive oxygen species，which mediate apoptosis in human cervical cancer cells[J]．Mol Carcinog,2004，40(4)：201-211.

[5] 趙艷麗，陸道培.白花丹醌對人急性早幼粒細胞白血病細胞的體外效應[J]. 中國實驗血液學雜志,2006，14(2)：208-211.

[6] Paschka P, Marcucci G, Ruppert AS, et al. Adverse prognostic significance of KIT mutations in adult acute myeloid leukemia with inv(16) and t(8;21): a Cancer and Leukemia Group B Study[J]. J Clin Oncol，2006，24(24):3904-3911.

[7] 楊 雷，楊聯萍，李茹冰，等. TRAIL對多種腫瘤細胞的殺傷作用[J].中國病理生理雜志，2007,23(6)：1236-1237、1239.

[8] Zhang L, Fang B. Mechanisms of resistance to TRAIL-induced apoptosis in cancer[J]. Cancer Gene Ther,2005，12(3): 228-237.

[9] Wen J, Nimmanapalli R, Nguyen D, et al. Antileukemic drugs increase death receptor 5 levels and enhance Apo-2L-induced apoptosis of human acute leukemia cells[J]. Blood,2000，96(12):3900-3906.

[10]Carter BD, Mak DH, Schober WD, et al. Triptolide sensitizes AML cells to TRAIL-induced apoptosis via decrease of XIAP and p53-mediated increase of DR5[J]. Blood，2008，111(7):3742-3750.

[11]Kang J，Bu J，Hao Y，et al．Subtoxic concentration of doxorubicin enhances TRAIL-induced apoptosis in human prostate cancer cell line LNCaP[J]．Prostate Cancer Prostatic Dis，2005，8(3)：274-279．

[12]Komdeur R，Meijer C，Van Zweeden M，et al．Doxorubicin potentiates TRAIL cytotoxicity and apoptosis and can overcome TRAIL-resistance in rhabdomyosarcoma cells[J]．Int J Oncol，2004，25(3)：677-684.

[13]Xu KH,Lu DP. Plumbagin induces ROS-mediated apoptosis in human promyelocytic leukemia cellsinvivo[J]. Leuk Res，2010，34(5): 658-665.

[14]Wieder T, Essmann F, Prokop A, et al. Activation of caspase-8 in drug-induced apoptosis of B-lymphoid cells is independent of CD95/Fas receptor-ligand interaction and occurs downstream of caspase-3[J]. Blood, 2001, 97(5): 1378-1387.

[15]Mahalingam D, Szegezdi E, Keane M,et al. TRAIL receptor signalling and modulation: Are we on the right TRAIL? [J].Cancer Treat Rev, 2009, 35(3): 280-288.

PlumbaginenhancesTRAIL-inducedapoptosisinKasumi-1cells

XU Tong-peng1, LIU Li-gen1,2, JIANG Xue-wei1, GAO Wu1, XIE Ying-hua1, ZHAO Li-min1, HAN Xi-yao1, LU Dao-pei1,2

(1DepartmentofHematology,TheFifthPeople’sHospitalofShanghai,BloodDiseaseResearchCenter,FudanUniversity,Shanghai200240,China;2ShanghaiDaopeiHospital,Shanghai200240,China.E-mail:liuligen@medmail.com.cn)

AIM: To investigate the effect of plumbagin and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) on the apoptosis of leukemic Kasumi-1 cells.METHODSKasumi-1 cells were treated with plumbagin alone, recombinant soluble TRAIL(rsTRAIL) alone or the combination of plumbagin with rsTRAIL to induce apoptosis. The cell proliferation was analyzed by CCK-8 assay. Apoptosis was determined by flow cytometry with AnnexinⅤ/PI double staining and TUNEL staining. The expression of DR4 and DR5 at mRNA level was measured by real-time PCR. The expression of signal transduction proteins, such as DR5, caspase-3, caspase-8, caspasep-9, Bid, Bax and c-FLIP was detected by Western blotting.RESULTSBoth rsTRAIL and plumbagin induced the apoptosis in Kasumi-1 cells, and combination of plumbagin with rsTRAIL enhanced the apoptosis. The ratios of Annexin V-positive Kasumi-1 cells were (27.7±2.9)%, (25.6±3.1)% and (52.1±3.3)% in 100 μg/L rsTRAIL group, 2 μmol/L plumbagin group and the combination group, respectively, and the positive rate in combination group was significantly higher than those in other 2 groups. TUNEL assay demonstrated that the number of apoptotic cells in combination group was higher than that in the cells treated with rsTRAIL or plumbagin alone. Plumbagin up-regulated the expression of DR5 at mRNA level in Kasumi-1 cells, and up-regulation of DR5, activation of caspase-8 and down-regulation of c-FLIP at protein level were detected in the cells treated with plumbagin alone and the combination of plumbagin with rsTRAIL.CONCLUSIONPlumbagin enhances TRAIL-induced apoptosis in Kasumi-1 cells by up-regulating DR5, activating caspase-8 and down-regulating c-FLIP.

Kasumi-1 cells; Apoptosis; Plumbagin; Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; Genes,DR5; Genes,DR4

R363

A

1000-4718(2011)03-0481-07

2010-11-15

2011-01-10

國家自然科學基金資助項目(No.30672415)；上海市科委攻關項目(No.054119528)

△通訊作者 Tel：021-24289908; E-mail: liuligen @medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.012