miRNA在去甲斑蝥素致K562細胞凋亡中的作用研究*

張 帥， 李有杰, 張 超， 岳 真, 張文娟， 劉在貴， 謝書陽△

(1濱州醫學院生物化學教研室，醫學分子遺傳學研究所，2煙臺山醫院，山東 煙臺 264003)

miRNA在去甲斑蝥素致K562細胞凋亡中的作用研究*

張 帥1， 李有杰1, 張 超1， 岳 真1, 張文娟2， 劉在貴1， 謝書陽1△

(1濱州醫學院生物化學教研室，醫學分子遺傳學研究所，2煙臺山醫院，山東 煙臺 264003)

目的探討miRNA在抗腫瘤藥物去甲斑蝥素(DMC)誘導K562細胞凋亡過程中的作用。方法DMC誘導細胞凋亡后，通過基因芯片技術分析miRNA表達改變，進一步用RT-PCR和定量PCR驗證部分miRNA的表達變化；并應用基因信息軟件分析miRNA相關的基因，ELISA驗證相關基因表達情況。結果DMC致凋亡組，基因芯片技術檢測到290多種miRNA的表達發生明顯改變，用RT-PCR和定量PCR分析結果示：在DMC處理組，miR-16、miR-34a和miR-125等表達增高1.5倍以上，而miR-106和miR-150的表達降低60%以上。通過microRNA TargetScan和miRanda軟件分析發現癌基因(bcl-2、E2F1、E2F3)和抑癌基因(RB1、p53)表達可能受上述miRNA表達的調控。 ELISA結果示：在DMC組，RB1和P53蛋白表達顯著增高，而Bcl-2、E2F1 和E2F3蛋白的表達顯著降低。結論DMC能誘導K562細胞發生凋亡，并能引起細胞內miRNA及相關基因的表達發生改變。

去甲斑蝥素； 細胞凋亡； 微小RNA； 基因表達

去甲斑蝥素(demethylcantharidin，DMC)是我國研制合成的斑蝥素衍生物，與斑蝥素相比，少了第2、3位甲基，其毒副作用明顯降低，對肺癌、肝癌、結腸癌[1]和乳腺癌[2]等多種腫瘤有明顯抑制作用，可選擇性地抑制腫瘤細胞生長，并具有抑制腫瘤轉移的活性。Kok等[3]報道DMC可以通過減少G1期細胞數目、降低caspase-3的活性，抑制急性髓細胞性白血病(acute myelocytic leukemia，AML)和慢性髓細胞性白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)細胞的增殖。最近研究報道DMC毒性小，可通過抑制肝性白血病因子(hepatic leukemia factor，HLF)誘導AML細胞的凋亡。

CML是白血病中的一種常見類型，多數患者生存期較短，目前臨床治療效果還有待進一步提高。本研究旨在探討miRNA在抗腫瘤藥物DMC誘導CML細胞株(K562)凋亡過程中的作用，擬通過觀察DMC對K562細胞的殺傷作用，進一步檢測miRNA及相關基因表達情況，觀察miRNA及相關基因表達在K562細胞凋亡中的作用，探討DMC的作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

DMC為西安海欣制藥有限公司產品(批號為H20052364)；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)為Sigma產品；胎牛血清和RPMI-1640培養基為Hyclone產品；RT-PCR試劑盒、PCR試劑盒和Trizol試劑盒等為大連寶生物公司產品；poly A tailing試劑盒為Ambion產品；兔抗人單克隆抗體為武漢博士德生物公司產品；羊抗兔IgG購自北京中山公司；引物由上海賽百盛生物科技有限公司合成。

2方法

2.1細胞株及細胞培養 K562細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所，使用加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養基進行培養，每2 d傳代1次，培養條件為37 ℃、5% CO2。

2.2DMC處理 待K562細胞生長至對數生長期時，將細胞分入12孔細胞培養板中，細胞的濃度調至5×108cells/L繼續培養12 h后用DMC處理。將細胞分為5組：空白對照組(不加DMC)；5 mg/L DMC組；10 mg/L DMC組；20 mg/L DMC組；30 mg/L DMC組。藥物作用0 h、12 h、24 h、36 h后分別取細胞進行實驗,實驗重復3次。

2.3MTT檢測 不同藥物濃度的細胞在處理相應的時間后，每孔細胞中加入MTT溶液 10 μL，繼續培養 4 h，收集細胞，4 000 r/min 離心 5 min，棄去上清液，每孔加DMSO 100 μL，搖勻后，使用酶標儀測定 570 nm 處吸光度(A)值，檢測細胞生長抑制率。

2.4倒置顯微鏡觀察 K562 細胞在經過上述不同濃度的DMC處理后，在相應時間內，置顯微鏡下觀測細胞形態改變。

2.5PI染色檢測 離心收集各孔細胞，用PBS洗1次，棄去上清，加入預冷的70%乙醇，重新吹散細胞，放入 4 ℃ 冰箱固定 24 h，再次離心收集細胞，加入PI(20 mg/L)溶液1 mL，吹散后染色 30 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.6miRNA表達譜芯片 采用北京博奧生物有限公司的哺乳動物microRNA 芯片V3.0，包含有924條探針。 Trizol一步法提取細胞中的總RNA，用PEG方法分離miRNA。利用T4 RNA 連接酶標記方法分別標記CU-Cy3 和CU-Cy5(Dharmacon)，然后再用無水乙醇沉淀，吹干后用于芯片雜交。芯片用 LuxScan 10K/A 雙通道激光掃描儀進行掃描。采用 LuxScan 3.0 圖像分析軟件對芯片圖像進行分析。

2.7RT-PCR 應用miRNA 提取試劑盒提取小 RNA，采用 poly A polymerase(PAP)對全部RNA添加poly A 尾，加尾后進行RT反應[RT引物：5’-AACATGTACAGTCCATGGATGd(T)30-3’]，操作按照試劑盒說明書進行。分別使用miR-16、miR-17、miR-34a-c、miR-106、miR-125及miR-150的引物擴增相應的miRNA，并且用人 5S rRNA引物擴增作為內參照基因 (上游引物見表1，下游引物為5’-AACATGTACAGTCCATGGATG -3’)。擴增條件為：94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，30 個循環。產物經 25 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 擴增miRNAs所用的上游引物

2.8實時定量PCR miRNA的檢測如下：制備cDNA后，對miR-16、miR-17、miR-20、miR-34a-c、miR-106、miR-125 及 miR-150進行檢測，人5S rRNA作為內參照，反應體系為 20 μL ，包含上、下游引物、10×緩沖液、dNTP、高保真DNA聚合酶、SYBR greenI染料等。定量反應條件為 94 ℃ 20 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，各擴增36個循環。在每個循環的 72 ℃ 時測定熒光量。

2.9ELISA檢測 用細胞裂解液提取細胞總蛋白。選擇每孔 100 μL 濃度為 5 mg/L鼠抗人IgG抗體，4 ℃包被過夜，每孔加入 10 g/L BSA 300 μL，37 ℃下封閉；每孔加100 μL蛋白提取液，37 ℃溫育；加100 μL兔抗人單克隆抗體Bcl-2、E2F1、E2F3、RB1及P53，后加羊抗兔IgG，TMB顯色液100 μL，50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，在酶標儀以450 nm波長測定各孔吸光度值。

3統計學處理

采用統計學軟件SPSS 13.0進行方差分析及t檢驗。

結 果

1DMC濃度和作用時間的篩選

MTT檢測結果顯示，在DMC作用下，隨著藥物濃度的增加，細胞生長抑制率也會逐步增加；藥物作用時間越長，細胞生長抑制率隨之增加。20 mg/L DMC作用 36 h 后，細胞生長抑制率已經超過50%,見圖1A、B。

圖1MTT分析細胞生長抑制率

2DMC致K562細胞形態學改變及凋亡分析

倒置顯微鏡觀察發現，在20 mg/L DMC作用36 h后，細胞形態發生顯著變化，細胞體積縮小，形態變得不規則，存活細胞明顯減少，見圖2A；流式細胞儀檢測結果顯示，20 mg/L DMC處理K562細胞12 h 后，細胞凋亡率為 13.30%；作用 36 h 后，細胞凋亡率為 46.65%，見圖2B。

Figure 2. The morphological changes of K562 cell induced by DMC and apoptotic rate analyzed by flow cytometry.A: a significant change in cell morphology(×400);B:evaluation of apoptotic incidence. The figures were obtained by flow cytometry analysis after treatment with 20 mg/L DMC for 0 h, 12 h and 36 h.

圖2DMC誘導K562細胞形態學改變及凋亡流式細胞分析

3DMC致凋亡細胞miRNA表達變化

miRNA基因芯片檢測結果示: 20 mg/L DMC作用 36 h 后，290多種miRNA的表達發生顯著變化，其中有 160 多個表達量增加 2 倍以上，而有 130 多個miRNA的表達顯著降低，見圖3A、B。通過 Cluster 3.0 對部分 miRNA 進行聚類分析發現：在DMC處理組，miR-16、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-17和miR-125的表達升高，而miR-106和miR-150的表達降低，見圖3C。進一步應用 RT-PCR和實時定量 PCR 對上述 miRNA 的表達進行驗證，在 DMC 處理組，miR-16、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-17和miR-125的表達明顯高于對照組；DMC可致miR-106和miR-150的表達降低，見圖4A、B。

4上述miRNA相關基因表達變化

研究已表明，bcl-2是miR-15b和miR-16調節的靶基因[4,5]、E2F1 mRNA的3’-UTR存在miR-17調控位點、E2F3受miR-125的調節、RB1與miR-106相關[6]、miR-150可調控p53基因的表達[7]。通過microRNA TargetScan和miRanda (edition for human miRNA targets)等軟件進一步分析了癌基因(bcl-2、E2F1、E2F3)和抑癌基因(RB1、p53)與相應miRNA的調控位點，見圖5。然后，用ELISA驗證了DMC處理前后上述基因表達情況，并分析了與miRNAs表達變化的關系。結果發現：在DMC組，RB1和P53蛋白表達顯著增高，而Bcl-2、E2F1和E2F3蛋白的表達顯著降低,見圖6。結果提示：上述基因受到其相關的miRNA表達調控，可能參與DMC致K562細胞凋亡過程。

Figure 3. Detection of miRNA expression by miRNA microarray.A: control group;B: DMC 20 mg/L;C: cluster analysis by Cluster 3.0.Control-1, 2, 3 and DMC-1, 2, 3: duplicate data for 3 times.

圖3miRNA基因芯片檢測miRNA表達

圖4RT-PCR和實時定量PCR檢測miRNA表達

Figure 5. Analysis of action sites between miRNAs and their regulating genes by gene informatics softwares.

圖5基因信息學軟件分析miRNA與調控基因作用位點

圖6ELISA檢測基因蛋白表達

討 論

miRNA是一類長度為19-25 nt的內源性非編碼RNA，可在轉錄水平或轉錄后水平調節基因的表達。成熟的 miRNA作用機制有2種：靶向降解mRNA或抑制翻譯，2種方式均可使相應基因的表達受到抑制。二者的區別在于，前者要求miRNA與靶mRNA嚴格互補；而后一個機制只要miRNA序列與靶向mRNA部分互補結合，就可發揮作用[8]。當某些miRNA表達上調，如果其靶基因為抑癌基因，就可致靶抑癌基因的表達下降，從而導致相應的蛋白質合成減少，可能對腫瘤的基因治療產生很大的影響；相反，另外一些以癌基因為靶基因的miRNA的表達下調，抑制作用減弱，可導致靶原癌基因的高表達，從而發生腫瘤。

本研究通過miRNA表達芯片技術發現：在DMC致K562細胞凋亡的過程中與對照組相比有290多種miRNA表達異常。進一步通過Cluster 3.0對部分miRNA進行聚類分析、real-time PCR等檢測發現：在DMC處理組，miR-16、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-17和miR-125的表達升高，而miR-106和miR-150的表達降低。應用基因信息軟件分析了這些miRNA與癌基因(E2F1、E2F3和bcl-2)和抑癌基因(p53和RB1)存在調控位點。bcl-2是一種重要的參與細胞凋亡調控的基因，作為癌基因其高表達與人類多種腫瘤發生有關[9]。miR-16可調節bcl-2的表達，在B細胞慢性白血病細胞中首次證實了miR-16的功能[10]。我們研究結果顯示DMC作用后，miR-16/34a-c與bcl-2的表達呈負相關，提示miR-16/34a-c與bcl-2可能參與DMC致K562細胞凋亡過程。與Trimarchi等[11]報道相似，研究中我們還發現miR-17可能作為上游因子調控E2F1基因的表達，后者作為癌基因，在胃癌、結腸癌等多種腫瘤的發生過程中表達升高[12]。從幼兒到成人發育過程中，miR-125作為保守因子在發揮作用[13]，Oeggerli等[14]的研究發現，E2F3可能是一種促發膀胱癌的癌基因，其在膀胱癌組織中的表達明顯高于正常膀胱組織。我們在研究中發現E2F3與miR-125的表達趨勢相反，參與了K562細胞凋亡。p53是與腫瘤發生、發展關系密切的抑癌基因，人類50%以上的腫瘤出現p53基因突變[15]。RB1基因是世界上第一個被克隆和完成全序列測定的抑癌基因，在視網膜母細胞瘤、白血病、骨髓瘤等腫瘤中表達顯著下降[16]。研究中發現抑癌基因RB1和p53 mRNA 存在miR-106和miR-150的調節位點，它們可能與上述癌基因一起參與 DMC 致白血病細胞凋亡過程。

傳統白血病化療藥物主要作用于分化后的白血病細胞，抑制細胞的增殖，與傳統化療藥物不同，DMC 還可以抑制急性髓性白血病干細胞及前期細胞。已有文獻報道：DMC 對 HL60 細胞株有較強增殖抑制作用,且有時間和劑量效應關系, DMC 對 HL60 細胞的抑制作用是通過干擾細胞的增殖和誘導細胞凋亡來實現的[17]。黃松音等[18]的研究發現，去甲斑蝥素能強烈抑制乳腺癌細胞株(SKBR3)的生長和增殖。上述研究表明 DMC 可以誘導 AML、DML 及人乳腺癌細胞發生凋亡,為白血病發病機制和臨床治療提供了重要的科學資料。

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EffectofmiRNAsonapoptoticleukemiacellsinducedbydemethylcantharidin

ZHANG Shuai1, LI You-jie1, ZHANG Chao1, YUE Zhen1, ZHANG Wen-juan2, LIU Zai-gui1, XIE Shu-yang1

(1InstituteofMedicalMolecularGenetics,DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BinzhouMedicalUniversity,2YantaishanHospital,Yantai264003,China.E-mail:shuyangxie@yahoo.com.cn)

AIM: To explore the role of miRNA expression in the process of antitumor drug demethylcantharidin (DMC)-induced leukemia cell apoptosis.METHODSK562 cells were treated with DMC to induce apoptosis. Microarray assessment was performed to detect the changes of miRNAs. The expression of miRNAs was further detected by RT-PCR and real-time PCR. The miRNA-relative genes were analyzed by gene information softwares,and their expression was determined by ELISA analysis.RESULTSThe results of microarray showed that more than 290 miRNAs were differentially expressed after DMC treatment. The expression of miR-16, miR-34 and miR-125 increased at more than 1.5 folds in DMC treatment group determined by RT-PCR and real-time PCR analysis, while both miR-106 and miR-150 were down-expressed over 60%. Using microRNA TargetScan and miRanda analysis software, we found that the expression of oncogenes (bcl-2,E2F1,E2F3) and tumor suppressor genes (RB1,p53) may be regulated by the above miRNAs. The expression of RB1 and P53 proteins significantly increased, while Bcl-2, E2F1 and E2F3 proteins were obviously down-regulated after DMC treatment.CONCLUSIONDMC induces K562 cell apoptosis by regulating the expression of miRNAs and their relative genes.

Demethylcantharidin; Apoptosis; miRNA; Gene expression

R733.7

A

1000-4718(2011)03-0499-05

2010-10-18

2011-01-04

國家自然科學基金資助項目(No.30801324)；山東省科技廳基金資助項目(No.ZR2009CQ033；No.2007BS03048)；濱州醫學院學術骨干及科研基金資助項目(No.BY2008KJ17)

△通訊作者 Tel：0535-6913335; E-mail:shuyangxie@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.015