坎地沙坦阻斷血管緊張素Ⅱ介導的原代急性髓樣白血病細胞增殖的作用及機制*

童秀珍， 陳自仁， 梁 瑋， 梁 樹， 李 娟， 羅紹凱， 陳運賢

(中山大學附屬第一醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510080)

坎地沙坦阻斷血管緊張素Ⅱ介導的原代急性髓樣白血病細胞增殖的作用及機制*

童秀珍△， 陳自仁， 梁 瑋， 梁 樹， 李 娟， 羅紹凱， 陳運賢

(中山大學附屬第一醫(yī)院血液科， 廣東 廣州 510080)

目的觀察血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1R)拮抗劑坎地沙坦抑制血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)介導的原代急性髓樣白血病(AML)細胞增殖的作用及機制。方法MTT法觀察Ang Ⅱ對原代AML細胞、正常骨髓單個核細胞增殖的影響以及坎地沙坦和AT2R拮抗劑 PD123319對AngII促原代AML細胞增殖的拮抗作用； Western blotting法觀察坎地沙坦和PI3K抑制劑對原代AML細胞Akt磷酸化的影響。結果AngII能劑量和時間依賴性促進原代AML細胞增殖(P<0.05)，而對正常骨髓無此作用。坎地沙坦隨濃度和時間依賴性阻斷Ang II作用下白血病細胞增殖(P<0.05)。PI3K抑制劑可抑制Ang II促進原代AML細胞的增殖(P<0.05)，坎地沙坦能明顯下調Ang II增加原代AML細胞Akt的磷酸化水平(P<0.05)。結論坎地沙坦通過抑制PI3K/Akt信號轉導途徑抑制Ang II/AT1R介導的白血病細胞增殖。

白血病髓樣,急性； 血管緊張素Ⅱ； 坎地沙坦； PI3K/Akt信號通路

血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的主要效應物質，通過與血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R)結合而影響機體的血壓和水電解質平衡,也會加速動脈硬化形成[1]。近年多項研究證實Ang Ⅱ在乳腺癌、膀胱癌等實體瘤細胞株、實體標本及動物模型中均顯示促進腫瘤細胞生長，AT1R拮抗劑坎地沙坦在膀胱癌動物模型中具有抗腫瘤作用[2,3]。有報道急性髓樣白血病患者骨髓中存在腎素、血管緊張素轉化酶及Ang Ⅱ及AT1R的過表達[4]。因此本研究旨在探討Ang II對原代急性髓樣白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者白血病細胞增殖的影響和AT1R拮抗劑坎地沙坦(candesartan)能否阻斷這種作用及機制，為將來進一步可能的臨床用藥提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1研究對象

32例除M3外成人AML骨髓標本來自2009年2月至2010年2月我院住院及門診初診AML患者，其中男性18例，女性14例，中位年齡43(11-82)歲。按FAB分型標準，其中M2 6例， M4 10例，M5 15例，M6 1例。26例非惡性血液病患者正常骨髓像的骨髓為對照組，男性14例，女性12例。

2方法

2.1MTT法測定細胞生長率 淋巴細胞分離液分離AML患者及正常骨髓單個核細胞，將細胞調至2×108cells/L,取0.1 mL加入96孔板，分別加入不同濃度(使其終濃度分別為10-9、10-8、10-7mol/L)的Ang II、AT1R拮抗劑坎地沙坦(1 μmol/L、10 μmol/L)、AT2R拮抗劑PD123319 (1 μmol/L、10 μmol/L)和PI3K/Akt抑制劑(LY294002, 20 μmol/L、40 μmol/L),實驗分組：Ang II單獨組、candesartan單獨組、PD123319單獨組、Ang II(10-7mol/L)+candesartan組和Ang II(10-7mol/L)+PD123319組、AngII(10-7mol/L)+ PI3K/Akt抑制劑(LY294002)組, 余加入含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，對照組為RPMI-1640培養(yǎng)基, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別培養(yǎng)時間6 h、12 h、24 h、48 h后,加入20 μL 5 g/L的MTT再培養(yǎng)4 h，然后離心棄培養(yǎng)液每孔加入100 μL的DMSO，搖床混勻10 min后，在酶標儀上用波長為570 nm測定A值，每組采用3個平行孔，并計算細胞增殖率和細胞抑制率(1-細胞增殖率)。

2.2Western blotting法檢測坎地沙坦對原代AML白血病細胞磷酸化Akt(p-Akt)的影響 分別收集candesartan(1 μmol/L,10 μmol/L)、LY294002(20 μmol/L,40 μmol/L)及Ang II(10-7mol/L)不同組合處理24 h后的細胞，冰凍PBS洗2次，加入細胞裂解液(1×PBS,1%Nonidet P-40,0.5%sodium deoxycholate，0.1%SDS,100 mg/L phenylmethylsul-fonyl fluoride，10 mg/L aprotinin，10 mg/L leupeptin)振蕩30 min，待裂解液澄清后離心(12 000×g，離心15 min，4 ℃)，取100 μg蛋白細胞裂解液，煮沸20 min，8% SDS-PAGE電泳，電轉移到PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),150 mmol/L NaCl,0.1%Tween]室溫封閉2 h，再分別加入單克隆抗體4 ℃下過夜，然后用TBST洗膜3次，再用1∶5 000稀釋的HRP-Ⅱ抗交聯(lián)物室溫下孵育2 h，最后再次用TBST洗3次，化學發(fā)光法X線下曝光顯影。用TINA軟件 2.10e對各組p-Akt蛋白結果的灰度值進行標準化，計算公式為：(p-Akt蛋白灰度吸收值-背景灰度吸收值)/(內參蛋白GAPDH-灰度吸收值-背景灰度吸收值)。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1AngII對原代AML細胞及正常骨髓單個核細胞增殖的影響

從圖1可見，當Ang II濃度為10-9mol/L并作用6 h時,即對原代AML細胞增殖有明顯的促進作用，與對照組(不加藥)比較差異顯著,P<0.05，隨劑量增加，這種促進作用進一步增強，不同濃度組比較，差異顯著,P<0.05；隨著作用時間延長，Ang II對原代AML細胞增殖率明顯增加，不同作用時間的比較，P<0.05。Ang II對正常骨髓單個核細胞增殖的影響見圖2，不同濃度Ang II對正常骨髓單個核細胞增殖無明顯影響(P>0.05)。

圖1AngII促進原代AML細胞增殖曲線

圖2AngII對正常骨髓單個核細胞增殖的影響

2坎地沙坦拮抗AngII作用下原代AML細胞增殖

表1可見,(1)培養(yǎng)12 h，分別加入1 μmol/L和10 μmol/L candesartan,細胞增殖率明顯減低，與對照組(Ang ll組)比較差異顯著，P<0.05。(2)培養(yǎng)24 h，對照組細胞增殖率為1.453±0.170，分別加入1 μmol/L和10 μmol/L 坎地沙坦，白血病細胞增殖率也明顯減低,分別為1.027±0.130和0.627±0.070,與對照組比較差異顯著，P<0.05，表明坎地沙坦能隨劑量和時間依賴性阻斷Ang II作用下白血病細胞增殖，AT2R拮抗劑PD12331未能阻斷Ang II作用下白血病細胞增殖，不呈劑量及時間依賴。

表1坎地沙坦對AngII作用下原代AML細胞增殖的影響

Group12h(A)24h(A)Control(AngII10-7mol/L)0．957±0．0901．453±0．170AngII+candesartan(1μmol/L)0．733±0．070?1．027±0．130?AngII+candesartan(10μmol/L)0．635±0．110?#0．627±0．070?#AngII+PD123319(1μmol/L)0．955±0．0801．443±0．120AngII+PD123319(10μmol/L)0．951±0．1101．459±0．070

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vs1 μmol/L candesartan group.

3坎地沙坦、PI3K抑制劑對AngII作用下原代AML細胞p-Akt的影響

從圖3可見，10-7mol/L AngⅡ促進AML細胞增殖，加入40 μmol/L PI3K 抑制劑LY294002可阻斷白血病細胞的增殖，坎地沙坦有類似PI3K 抑制劑LY294002的作用。

Western blotting法檢測各組p-Akt蛋白的水平，10-7mol/L Ang II組p-Akt蛋白灰度值明顯高于空白對照組(2.32±0.20vs0.25±0.10,P<0.05),加入10 μmol/L坎地沙坦處理后p-Akt蛋白灰度值明顯降低(0.57±0.10vs2.32±0.20，P<0.01)，說明Ang II與AT1R結合經(jīng)PI3K/Akt信號途徑促進原代AML細胞增殖，坎地沙坦通過下調白血病細胞Akt蛋白磷酸化途徑抑制細胞增殖，見圖4。

圖3坎地沙坦及PI3K抑制劑對AngII作用下原代AML細胞增殖的影響

圖4坎地沙坦對AngII作用下原代AML細胞Akt磷酸化的影響

討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)RAS在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、絨癌等實體腫瘤中存在過表達，AT1R拮抗劑能抑制這些腫瘤細胞的生長[2,3,8]。RAS系統(tǒng)也參與造血調控，有研究報道AngⅡ作用于AT1R促進紅系分化、促進造血祖細胞增殖，氯沙坦可阻斷增殖效應[5]，RAS 在急性白血病中也起重要作用， Koca等[6]報道白血病K562細胞株過表達腎素、血管緊張素轉化酶、血管緊張素原及AT1R和AT2R。有報道在AML患者骨髓中存在腎素、血管緊張素轉化酶及血管緊張素的過表達[4]。在腎素表達陽性白血病患者中，化療完全緩解(CR)時腎素表達消失，在復發(fā)時腎素再次表達;而在化療不敏感的AML患者中腎素持續(xù)表達[7]。但Ang II對原代AML細胞增殖體外實驗報道較少見,我們的研究發(fā)現(xiàn)Ang II體外可促進AML細胞的增殖，隨著Ang Ⅱ濃度增大及作用時間延長，這種促進作用進一步增強，在Ang Ⅱ濃度為10-7mol/L時這種促進作用達到最大，而Ang Ⅱ對正常骨髓單個核細胞生長無促進作用,這一結果與文獻報道的AML患者存在Ang Ⅱ的過表達[4]相符合，說明AngII在AML發(fā)病中起重要作用。

AngⅡ在實體瘤中的作用機制，有研究證實在膀胱癌動物中AngⅡ通過AT1R使血管內皮細胞因子(VEGF)水平升高促進腫瘤生長[3]；激活MAPK(促分裂激活蛋白激酶)信號途徑促進乳腺癌細胞生長[2]；也有發(fā)現(xiàn)Ang II激活AT1R后通過PI3K/Akt信號途徑增強絨毛膜癌BeWo細胞株遷移和侵襲[8]。但Ang II對急性白血病的作用機制仍不清楚，有報道AT1R拮抗劑氯沙坦抑制K562、HL60和U937細胞增殖不依賴于c-myc和bcl-2基因表達的下降，其促細胞凋亡作用也不是通過下調c-myc、bcl-2和bcl-x基因表達來實現(xiàn)，其機制可能與這些藥物阻斷AngⅡ經(jīng)AT1R激活Smad有關[9]；有研究表明持續(xù)激活的變異型STAT5通過PI3K/Akt信號轉導途徑誘導造血惡性細胞株(Ba/F3)生長及維持其生存，阻斷PI3K/Akt信號途徑后抑制細胞增殖，我們觀察Ang II促白血病細胞增殖是否通過PI3K/Akt(Akt是PI3K的主要下游效應分子之一)信號途徑而起作用，我們的結果顯示PI3K 抑制劑LY294002可阻斷Ang II誘導的白血病細胞的增殖，坎地沙坦可以下調Ang II誘導白血病細胞Akt蛋白磷酸化，提示Ang II與其AT1R結合經(jīng)PI3K/Akt信號途徑促進原代AML細胞增殖，坎地沙坦可阻斷該途徑。

AT1R拮抗劑坎地沙坦能劑量和時間依賴性阻斷Ang II作用下原代AML細胞增殖，這一結果與De la Iglesia Iigo等[9]報道血管緊張素轉換酶抑制劑群多普利、AT1R拮抗劑氯沙坦對體外培養(yǎng)的白血病細胞株K562、HL60、U937和 KU812的增殖具有抑制作用相符合，提示AT1R受體拮抗劑具有一定的抗白血病作用。在其它研究中許多證據(jù)顯示ACEI 和AT1R拮抗劑可能是抗血管生成、抗腫瘤細胞生長和抗癌細胞侵襲的新抗腫瘤藥，Kosugi等[10]報道在膀胱癌動物模型中顯示坎地沙坦聯(lián)合紫杉醇具有協(xié)同抗腫瘤作用。Wilop等[11]報道52例晚期非小細胞肺癌患者長期服用血管緊張素轉化酶抑制劑或者AT1R拮抗劑聯(lián)合以鉑類藥物為一線化療藥物的化療方案，其生存率較單純以鉑類藥物為一線化療藥物的患者生存率高[11],但AT1R拮抗劑對急性白血病的臨床療效還有待進一步證實。

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AntagonisticeffectofangiotensinIItype1receptorblockercandesartanonangiotensinII-inducedproliferationofprimaryacutemyeloidleukemiacells

TONG Xiu-zhen, CHEN Zi-ren, LIANG Wei, LIANG Shu, LI Juan, LUO Shao-kai, CHEN Yun-xian

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:tongxz05@163.com)

AIM: To explore the antagonistic effect and mechanism of candesartan on angiotensin II (Ang II)-induced proliferation of primary acute myeloid leukemia (AML)cells.METHODSMTT assay was used to observe the proliferation effect of Ang II on primary AML cells and normal bone marrow mononuclear cells, and the antagonistic effects of candesartan[an antagonist of angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1R)] and PD123319 (an antagonist of AT2R) were also observed. Akt phosphorylation was detected by Western blotting when the cells were treated with candesartan and a PI3K inhibitor LY294002.RESULTSCompared with the control cells, Ang II significantly increased the proliferation of AML cells in a dose-and time-dependent manner (P<0.05). Ang II did not stimulate the proliferation of normal bone marrow mononuclear cells. The proliferative effect of Ang II was effectively blocked by the AT1R blocker candesartan (P<0.05). PI3K inhibitor strongly repressed the Ang II-induced cell proliferation (P<0.05). Candesartan significantly reduced Akt phosphorylation promoted by Ang II on primary AML cells (P<0.05).CONCLUSIONCandesartan effectively inhibits Ang II-induced proliferation of primary AML cells by down-regulating PI3K/Akt signaling pathway, indicating a new possible treatment mechanism in some AML cells.

Leukemia,myeloid,acute; Angiotensin II; Candesartan; PI3K/Akt signaling pathway

R733.71

A

1000-4718(2011)03-0514-04

2010-07-06

2011-01-05

廣東省科技計劃資助項目(No.2010B031600077)

△通訊作者 Tel：020-87755766-8911;E-mail：tongxz05@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.018