漢黃芩素對流感病毒感染肺泡巨噬細胞炎癥相關因子的影響*

吳 瑩, 金葉智, 吳 珺， 于雪飛， 郝 鈺

(北京中醫藥大學中醫藥防治病毒性疾病教育部重點實驗室，北京 100029)

漢黃芩素對流感病毒感染肺泡巨噬細胞炎癥相關因子的影響*

吳 瑩, 金葉智, 吳 珺， 于雪飛， 郝 鈺△

(北京中醫藥大學中醫藥防治病毒性疾病教育部重點實驗室，北京 100029)

目的研究漢黃芩素對甲型流感病毒鼠肺適應株A/FM/1/47(H1N1)感染的大鼠肺泡巨噬細胞(NR8383)產生促炎癥細胞因子、炎癥介質及氧自由基的影響。方法流感病毒感染 NR8383細胞1 h后，加入含漢黃芩素的培養基(終濃度16 mg/L)，藥物作用后6 h、12 h和24 h，ELISA法檢測細胞上清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和單核細胞趨化蛋白 1(MCP-1)的含量，放射免疫測定法檢測細胞上清中前列腺素E2(PGE2)、磷脂酸A2(PLA2)和白三烯B4(LTB4)的含量；藥物作用后8 h、24 h、36 h和48 h，生化法檢測細胞內一氧化氮(NO)含量和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)活性，4 h、8 h、18 h和24 h，生化法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；藥物作用后24 h，real-time PCR檢測細胞內TNF-α和MCP-1的mRNA水平。結果漢黃芩素抑制了流感病毒感染NR8383細胞后TNF-α、MCP-1的轉錄和表達(P<0.01)，降低了PGE2、PLA2、LTB4和MDA的含量(P<0.05)；減少了NO和iNOS的產生(P<0.05)，增強了SOD的活性(P<0.05)。結論漢黃芩素明顯抑制了流感病毒感染后肺泡巨噬細胞內各種炎癥相關因子的產生，具有抗炎作用。

漢黃芩素； 流感病毒A型； 巨噬細胞，肺泡； 細胞因子類

中藥黃芩是用于治療流感的復方中的常用組分(如毒熱平注射液，雙黃連口服液等)，其主要有效成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素[1]。研究表明，黃芩提取物及黃芩苷、黃芩素在體內外均具有直接抗流感病毒的作用，然而，漢黃芩素在抗流感治療中的作用目前尚不清楚[2，3]。流行性感冒病毒是成年人和老人病毒性肺炎最為常見的病原體。在流感病毒性肺炎的發病機制中，除病毒感染的直接損傷外，病毒引起的免疫損傷也起著重要作用，其中，肺泡巨噬細胞是啟動肺部炎癥反應的關鍵細胞。流感病毒感染后刺激肺泡巨噬細胞產生過量的炎癥因子、炎癥介質及氧自由基，加重肺內炎癥反應[4，5]。因此，本研究旨在通過分析漢黃芩素對甲型流感病毒鼠肺適應株A/FM/1/47(H1N1)感染大鼠肺泡巨噬細胞(NR8383)后產生的炎癥細胞因子、炎癥介質及氧自由基的影響，明確漢黃芩素在抗流感病毒治療中發揮的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1病毒與細胞 甲型流感病毒鼠肺適應株A/FM/1/47(H1N1)，由中國預防醫學科學院病毒學研究所提供，-76 ℃保存備用。于9 d齡雞胚尿囊腔連續傳代2次后，測血凝滴度為1∶512，病毒的半數組織培養感染劑量(median tissue culture infective dose,TCID50)為103.6/L。大鼠肺泡巨噬細胞系(NR8383)購于中國科學院細胞庫，由本室傳代后使用。

1.2藥物與試劑 漢黃芩素(批號111514-200403)為中國藥品生物制品檢定所產品，配成10 g/L的原藥液。F12K干粉購于Sigma；胎牛血清為Hyclone產品；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium， MTT)為Amresco產品。大鼠單核細胞趨化蛋白 1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)ELISA試劑盒購于BD。大鼠腫瘤壞死因子( tumor necrosis factor-alpha，TNF-α) ELISA 試劑盒購于深圳晶美公司。白三烯B4(leukotriene B4, LT-B4)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和磷脂酶A2(phospholipase A2, PLA2)放射免疫測定試劑盒購于北京華英生物技術研究所。丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。Griess試劑由本室配制，4 ℃保存。RIPA裂解液(批號為092003)購于北京尚柏生物技術有限公司產品。Trizol試劑購于Invitrogen。反轉錄試劑購于Fermentas MBI。 PCR試劑購于大連寶生物工程有限公司。SYBR Green試劑購于北京天根生化科技有限公司。

1.3熒光定量PCR引物 MCP-1引物：上游5’-GGGTCCAGAAGTACATTAGA-3’，下游5’-GCTGAAGTCCTTAGGGTTGA-3’。TNF-α引物：上游5’-CCACGCTCTTCTGTCTACTG-3’ ，下游5’-GCTACGGGCTTGTCACTC-3’。內參照β-actin引物：上游5’-CCACTGCCGCATCCTCTT-3’，下游5’-GCATCGGAACCGCTCATT-3’。以上引物均由北京凱諾春天生物科技有限公司合成。

2方法

2.1藥物細胞毒性實驗 NR8383細胞為半貼壁半懸浮細胞，待細胞生長狀態良好時，吹打消化細胞，用培養液調整細胞至5×108cells/L，將該細胞液加入96孔板中，90 μL/well，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。用培養液將漢黃芩素用2倍稀釋法稀釋為不同濃度，加入細胞培養板中，10 μL/well，使藥物的終濃度為0.032 g/L、0.016 g/L、0.008 g/L、0.004 g/L、0.002 g/L、0.001 g/L，每個藥物稀釋濃度平行做6個復孔，同時設正常細胞對照。于37 ℃、5% CO2培養48 h后，用MTT(終濃度0.5 g/L)比色法檢測藥物對NR8383細胞的毒性，計算細胞存活率。細胞存活率(%) =實驗組吸光度值(A)/細胞對照組吸光度值(A)×100%，確定藥物最大無毒濃度(TC0)。

2.2ELISA檢測MCP-1和TNF-α 接種5×108cells/L NR8383細胞至24孔板，500 μL/cell，用100 TCID50的流感病毒感染NR8383細胞后，置37 ℃、5% CO2培養箱中吸附1 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入0.16 g/L的漢黃芩素藥液，500 μL/cell，同時設正常細胞對照和病毒對照。置37 ℃、5%CO2培養箱中分別培養6 h、12 h、24 h后，1 000 r/min 離心5 min，吸取上清，按ELISA試劑盒說明書檢測上清中MCP-1和TNF-α含量。

2.3熒光定量PCR檢測MCP-1和TNF-α mRNA水平 藥物作用于流感病毒感染的NR8383細胞后24 h，吹打消化細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞樣品，用PBS溶液洗滌3次后，加入1 mL Trizol試劑，混勻，按試劑操作說明書提取細胞總RNA。取2 μg 總RNA為模板，以寡核苷酸Oligo(dT)為引物，反轉錄反應體系為25 μL，按反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。

PCR擴增按SYBR green試劑說明書進行：反應體系為40 μL，含2×mixture 20.0 μL，模板 1.0 μL，上游引物(20 μmol/L)1.0 μL，下游引物(20 μmol/L)1.0 μL，無菌水17.0 μL。擴增條件為：50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min,然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，讀板，共40個循環。

2.4放射免疫測定法(RIA)檢測PGE2、PLA2和LTB4樣品準備方法同2.2所示，按試劑盒說明書檢測上清中PGE2、PLA2和LTB4含量。

2.5生化法檢測細胞MDA、NO含量和SOD、iNOS活性 SOD活性的檢測采用黃嘌呤氧化酶法，MDA的檢測采用TBA法，樣品準備方法同2.2所示。用藥后4 h、8 h、18 h和24 h，吸取細胞上清，按試劑盒說明書檢測上清中MDA含量和SOD活性。NO的檢測采用Griess試劑，用藥后8 h、24 h、36 h和48 h，取細胞上清100 μL，加入Griess 試劑，100 μL/well，室溫顯色10 min，酶標儀530 nm下測定各孔的A值。iNOS活性的檢測采用比色法，用藥后8 h、24 h、36 h、48 h，1 000 r/min離心5 min，棄細胞上清，加入200 μL細胞裂解液，吹打混勻后，12 000 r/min離心4 min，取上清100 μL，按試劑盒說明書檢測細胞內iNOS活性。

3統計學處理

結 果

1漢黃芩素對NR8383細胞的毒性測定

MTT的檢測結果顯示，當漢黃芩素的濃度分別

為0.032 g/L、0.016 g/L、0.008 g/L、0.004 g/L、0.002 g/L和0.001 g/L時，對應NR8383細胞存活率為70.66%、94.25%、99.83%、95.08%、93.64%和99.82%，漢黃芩素對NR8383細胞的的最大無毒濃度為0.016 g/L。

2漢黃芩素抑制流感病毒感染NR8383細胞后MCP-1和TNF-α的轉錄與表達

流感病毒感染肺泡巨噬細胞后，細胞上清中MCP-1的含量明顯增加，在各時點與正常細胞組比較均有顯著差異(P<0.01)。漢黃芩素作用后，降低了巨噬細胞分泌的MCP-1含量，用藥后6 h、12 h和24 h，與病毒組比較均有顯著差異(P<0.01)，見圖1A。而病毒感染后TNF-α的含量在 12 h和24 h升高，與正常細胞組比較有顯著差異(P<0.01)，漢黃芩素作用后，降低了巨噬細胞分泌的TNF-α含量，與病毒組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖1B。漢黃芩素抑制了流感病毒感染后肺泡巨噬細胞MCP-1和TNF-α的轉錄，與病毒組比較差異顯著(P<0.01)，見表1。

圖1漢黃芩素對流感病毒感染NR8383細胞后MCP-1和TNF-α分泌的影響

表1漢黃芩素對流感病毒感染NR8383細胞后MCP-1和TNF-α轉錄的影響

GroupMCP-1mRNA/β-actinmRNATNF-αmRNA/β-actinmRNANormal0．1577±0．0224??0．0304±0．0006??Virus0．4767±0．11000．3746±0．0505Virus+wogonin0．2775±0．0807??0．1704±0．0203??

**P<0.01vsvirus group.

3漢黃芩素對流感病毒感染NR8383細胞后PGE2、PLA2和LTB4分泌的影響

流感病毒感染肺泡巨噬細胞后，培養上清液中PGE2的含量在6 h時有明顯增加，與正常細胞組相比有顯著差異(P<0.05)，隨后降低，與正常細胞組相比無顯著差異(P>0.05)，漢黃芩素作用后PGE2的分泌有一定的降低，但作用不明顯，與病毒組相比無顯著差異(P>0.05)，見圖2A。病毒組PLA2的含量在24 h時升高，與正常細胞組相比有顯著差異(P<0.05)，而漢黃芩素在用藥后6 h明顯降低了PLA2的含量，與正常細胞組、病毒組相比均有顯著差異(P<0.01)，其它時點則未表現出對PLA2的抑制作用，見圖2B。病毒組LTB4的含量在6 h、12 h時升高，與正常細胞組相比有顯著差異(P<0.05)，漢黃芩素在用藥后12 h對LTB4分泌的抑制作用最明顯，與病毒組相比有顯著差異(P<0.01)，見圖2C。

圖2漢黃芩素對流感病毒感染NR8383細胞后PGE2、PLA2和LTB4含量的影響

4漢黃芩素降低流感病毒感染NR8383細胞后NO含量和iNOS活性

肺泡巨噬細胞受流感病毒感染刺激后，NO分泌逐漸增多，漢黃芩素作用后明顯降低了病毒刺激后細胞NO的分泌至幾乎與正常細胞相同水平。用藥后24 h、36 h和48 h，漢黃芩素組的NO含量與病毒組相比有顯著差異(P<0.01),見圖3A。而細胞內iNOS活性的變化與上清中NO的變化一致，用藥后24 h、36 h和48 h，漢黃芩素組iNOS活性與病毒組相比有顯著差異(P<0.05)，見圖3B。

5漢黃芩素降低MDA的含量，增強SOD的活性

流感病毒感染后，NR8383細胞中MDA含量增加，而漢黃芩素降低了病毒刺激后細胞MDA的含量，用藥后4 h和8 h，漢黃芩素組MDA的含量與病毒組相比有顯著差異(P<0.05)。流感病毒感染后細胞內SOD的活性降低，表明細胞清楚氧自由基的能力降低，而漢黃芩素作用后增強了SOD活性，用藥后4 h、8 h，與病毒組相比有顯著差異(P<0.05，P<0.01)。

圖3漢黃芩素對流感病毒感染NR8383細胞內NO含量和iNOS活性的影響

圖4漢黃芩素對流感病毒感染NR8383細胞中MDA含量及SOD活性的影響

討 論

病毒性肺炎是流感病毒感染后最嚴重的并發癥，導致較高的死亡率[6]。流感病毒性肺炎的病理變化，是由病毒復制引起感染細胞的直接損傷與宿主的免疫反應共同作用的結果[7]。研究表明，小鼠流感病毒感染致命的后果更多的是取決于宿主的免疫病理損傷，而非病毒復制所致的直接細胞損傷[8]。

既往研究表明，黃芩提取物在小鼠流感病毒感染模型上能起到抗流感病毒的作用[2]。我們的前期研究對黃芩的主要單體成分黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素的體外抗流感病毒的作用進行了比較，結果表明，黃芩苷在體外抗流感病毒作用最強，而漢黃芩素在體外無明顯的抗病毒作用[9]。

然而，近期研究表明，漢黃芩素具有明顯的抗炎、抗氧化作用，能明顯抑制中樞神經系統巨噬細胞(小膠質細胞)活化后IL-6、NO、MCP-1以及調節激活正常T細胞表達和分泌因子(regulated upon activation,normal T-cell expressed and secreted,RANTES)等炎癥相關因子的分泌，起到神經保護作用[10,11]。因此，我們設想，漢黃芩素可能通過抑制流感病毒感染后與宿主的免疫反應，減輕免疫損傷，從而起到抗流感病毒感染后炎癥反應的作用。本研究以流感病毒鼠肺適應株感染的大鼠肺泡巨噬細胞(NR8383)細胞為模型，從3個方面分析了漢黃芩素對病毒感染后NR8383細胞分泌的炎癥相關因子的影響。

1漢黃芩素對流感病毒感染NR8383細胞后TNF-α和MCP-1轉錄及表達的影響

TNF-α是病毒感染后最早釋放的前炎癥介質之一，是肺部炎癥病變中最主要的促進因子，主要由肺泡巨噬細胞產生。過量的TNF-α能誘導肺內皮細胞活化、白細胞遷移、粒細胞脫顆粒和毛細血管滲漏等，從而誘發并進一步加重炎癥反應。炎癥反應發生時，炎性細胞在趨化因子作用下向病灶游走。其中CC家族趨化因子MCP-1主要參與單個核細胞浸潤[12]。研究表明，巨噬細胞受流感病毒感染刺激后， MCP-1和TNF-α的轉錄和表達明顯增強，漢黃芩素抑制了流感病毒感染后肺泡巨噬細胞MCP-1、TNF-α的轉錄和表達，與病毒組比較差異顯著(P<0.01)。

2漢黃芩素對流感病毒感染NR8383細胞后炎癥介質PGE2、PLA2和LTB4分泌的影響

PGE2是花生四烯酸代謝過程中產生的1個重要炎癥介質，可通過其強大的擴血管促進炎癥反應發生發展。病毒刺激是導致PLA2激活的原因之一，激活的PLA2作用于細胞膜磷脂，產生花生四烯酸，其代謝產物LTB4具有很強的嗜中性粒細胞趨化活性和淋巴細胞增殖作用，是目前已知最強的中性粒細胞催化因子和活化因子之一[13,14]。本研究表明，流感病毒感染肺泡巨噬細胞后，上清中PGE2、PLA2和LTB4的含量均有所增加。漢黃芩素能明顯降低PLA2和LTB4的含量(P<0.05)，對PGE2的分泌有一定的降低，但作用不明顯，與病毒組相比無顯著差異(P>0.05)。

3漢黃芩素對流感病毒感染NR8383細胞后NO、iNOS、SOD和MDA產生的影響。

NO 是重要的炎癥介質，高水平NO導致細胞毒性作用，介導免疫損傷。iNOS主要在各種炎癥情況下表達，NO的大量產生可能來源于iNOS誘導表達[15]。MDA的水平反映脂質過氧化程度，而SOD是機體重要的抗氧化酶，可清除自由基，減輕氧化損傷[16,17]。MDA間接反映細胞損傷程度，SOD活性反映機體清除氧自由基的能力。本研究表明，肺泡巨噬細胞受流感病毒感染刺激后，iNOS和NO的含量逐漸增多，漢黃芩素作用后明顯降低了病毒刺激后細胞NO和iNOS的水平。NR8383細胞中MDA的含量在流感病毒感染后增加，表明細胞膜產生了脂質過氧化損傷，而漢黃芩素降低了病毒刺激后細胞MDA的含量，增強了SOD活性。

綜上，本研究證實了漢黃芩素對流感病毒感染后肺泡巨噬細胞炎癥相關因子的產生具有明顯的抑制作用，明確了漢黃芩素在抗流感治療中發揮了抗炎的作用，為漢黃芩素的藥理作用增加了新的內容。我們設想，黃芩主要通過黃芩苷、黃芩素直接抗流感病毒，而通過漢黃芩素抑制流感病毒感染后的炎癥級聯反應，從而起到既抗病毒又抗炎的作用，這為黃芩臨床治療流感病毒性肺炎提供了實驗依據與基礎。

[1] 宋旦哥，孟慶剛. 黃芩藥理作用研究述評[J]. 中華中醫藥學刊，2009，27(8)：1619-1621.

[2] 初 明,初正云,王丹丹. 復方黃芩提取物對小鼠體內流感病毒mRNA復制和干擾素(IFN)表達的影響[J]. 中藥材,2007,30 (1):63-65.

[3] 吳修華，劉 妮，楊 麗，等. 黃芩素體內抗甲型流感病毒作用的研究[J]. 廣州中醫藥大學學報，2009，26(2):157-159、200.

[4] Seo SH, Webby R, Webster RG. No apoptotic deaths and different levels of inductions of inflammatory cytokines in alveolar macrophages infected with influenza viruses[J]. Virology, 2004,329(2):270-279.

[5] Snelgrove RJ, Edwards L, Rae AJ,et al. An absence of reactive oxygen species improves the resolution of lung influenza infection[J]. Eur J Immunol, 2006, 36(6):1364-1373.

[6] Wang J, Oberley-Deegan R, Wang S, et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-λ1) in response to influenza A infection[J]. J Immunol, 2009, 182(3):1296-1304.

[7] Kim HM, Lee YW, Lee KJ, et al. Alveolar macrophages are indispensable for controlling influenza viruses in lungs of pigs[J]. J Virol, 2008， 82(9):4265-4274.

[8] Shimomura E, Suzuki F, Ishida N. Characterization of cells infiltrating the lungs of x-irradiated and nude mice after influenza virus infection[J]. Microbiol Immunol, 1982, 26(2): 129-138.

[9] 吳 瑩, 金葉智, 吳 珺，等. 黃芩主要成分體外抗甲型流感病毒作用的研究[J].北京中醫藥大學學報, 2010, 33(8)：541-545.

[10]樸花子，于兆霞，樸日龍，等. 漢黃芩素對脂多糖誘導一氧化氮和單核細胞趨化蛋白-1的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 2007, 23(3)：20-21.

[11]樸花子，鄭善子，崔萬善. 漢黃芩素對脂多糖誘導細胞因子IL-6和趨化因子RANTES的影響[J].中藥藥理與臨床, 2008, 24(6)：34-36.

[12]沈 燕，熊思東.MCP-1結構與功能的分子基礎[J].生命的化學, 2002,22(1)：58-60.

[13]Lin WW,Chen BC. Pharmacology comparison of UTP-and thapsigargin-induced acid release in mouse RAW 264.7 macrophages[J]. Br J Pharmacol, 1998, 123(6):1173-1181.

[14]Sampson SE, Costello JF, Sampson AP. The effect of inhaled leukotriene B4 in normal and in asthmatic subjects[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 155(5):1789-1799.

[15]Michel T，Feron O.Nitric oxide synthase：which，where，how，and why?[J].J Clin Invest,1997, 100(9):2146-2152.

[16]李建強，高曉玲，劉卓拉，等.膽紅素對抗脂多糖誘導致大鼠急性肺損傷的實驗研究[J].中國病理生理雜志, 2005, 21(4)：780-783.

[17]王秋林，王浩毅，王樹人.氧化應激狀態的評價[J].中國病理生理雜志, 2005, 21(10)：2069-2074.

Effectsofwogoninoninflammation-relatedfactorsinalveolarmacrophagesinfectedwithinfluenzavirus

WU Ying, KIM Ye-ji, WU Jun, YU Xue-fei, HAO Yu

(KeyLaboratoryofChineseMedicineonViralDisease,MinistryofEducation,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China.E-mail:yuhao64@sina.com)

AIM: To study the effects of wogonin on A inflammatory cytokines, inflammatory mediators and oxygen free radical generated from rat alveolar macrophages (NR8383) infected with influenza A virus adapted to mouse A/FM/1/47(H1N1).METHODSAfter 1 h adsorption of the influenza virus, the medium containing 16 mg/L wogonin was added to NR8383 cells. At 6 h, 12 h and 24 h of wogonin exposure, the cultured supernatants were collected and the concentrations of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) were measured by ELISA. The concentrations of inflammatory mediators prostaglandin E2(PGE2), phospholipase A2(PLA2) and leukotriene B4(LTB4) were detected by radioimmunoassay (RIA). At 8 h, 24 h, 36 h and 48 h after wogonin exposure, the concentration of nitric oxide(NO) and the activity of inducible nitric oxide synthase(iNOS) were determined by biochemical detection. At 4 h, 8 h, 18 h and 24 h after wogonin exposure, biochemical detection was also used to measure the activity of superoxide dismutase(SOD) and the concentration of malondialdehyde(MDA). The mRNA levels of TNF-α and MCP-1 were determined 24 h after drug application by real-time PCR.RESULTSWogonin inhibited the transcription and expression of TNF-α and MCP-1 in NR8383 cells infected with the influenza virus (P<0.01), and reduced the concentrations of PGE2, PLA2, LTB4and MDA (P<0.05). Wogonin also reduced the production of NO and the activity of iNOS (P<0.05), and increased the activity of SOD (P<0.05).CONCLUSIONWogonin obviously inhibits the production of various inflammation-related factors in alveolar macrophages infected with influenza virus, indicating its anti-inflammatory mechanism on influenza virus infection.

Wogonin; Influenza A virus; Macrophages,alveolar; cytokines

R285.5

A

1000-4718(2011)03-0533-06

2010-09-08

2010-11-22

國家自然科學基金資助項目(No. 30772871)

△通訊作者 Tel：010-64286973； E-mail: yuhao64@sina.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.022

本文獲2010年中國病理生理學會炎癥發熱感染低溫專業委員會和中醫專業委員會第12屆聯合學術交流會青年優秀論文一等獎