氧化低密度脂蛋白對人臍靜脈內皮細胞connexin43表達的影響*

章順榮， 洪鳴鳴， 高 越， 王曉楠， 封 菲

(杭州市第一人民醫院老年醫學科， 浙江 杭州 310006)

氧化低密度脂蛋白對人臍靜脈內皮細胞connexin43表達的影響*

章順榮△， 洪鳴鳴， 高 越， 王曉楠， 封 菲

(杭州市第一人民醫院老年醫學科， 浙江 杭州 310006)

目的研究氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)對體外培養的人臍靜脈內皮細胞縫隙連接蛋白connexin43表達的影響。方法體外培養的內皮細胞分為4組：對照組，50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L ox-LDL干預組，干預24 h后通過RT-PCR方法檢測各組connexin43 mRNA的表達有無差別；通過免疫細胞化學方法檢測對照組和100 mg/L ox-LDL干預組之間connexin43蛋白的表達水平有無差別。結果不同濃度(50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)的ox-LDL干預24 h能引起內皮細胞connexin43 mRNA的表達增加(P<0.01)；100 mg/L的ox-LDL干預24 h內皮細胞connexin43蛋白表達增加(P<0.01)。結論Ox-LDL短期干預可引起人臍靜脈內皮細胞connexin43 mRNA和蛋白表達水平增加。

連接蛋白43； 脂蛋白類，低密度； 人臍靜脈內皮細胞

動脈粥樣硬化(atherosclerosis)是威脅人類健康的最常見的疾病之一，常引起重要臟器的嚴重病變(比如心肌梗死和腦梗死等)，而且隨著人口的老齡化，其發生率有逐年上升趨勢。然而，其發病機制目前尚未完全清楚，研究表明多種因素參與了動脈粥樣硬化的發生、發展，其中內皮細胞功能異常起著重要的作用。組成縫隙連接(gap junction communication, GJIC)的蛋白亞單位稱為connexins，現已發現有20種以上的connexins亞型，而內皮細胞表面有connexin43、40和37的表達。研究表明connexin43的改變在內皮細胞功能異常和動脈粥樣硬化的發生發展中可能起著重要的作用[1]。另一方面，氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL, Ox-LDL)在動脈粥樣硬化的發生發展中起著關鍵的作用[2]，內皮下脂質沉留是動脈粥樣硬化的始動因素[3]，ox-LDL可以通過多種機制促進動脈粥樣硬化的發生發展[4]。目前尚未見研究報道ox-LDL是否可以通過影響內皮細胞connexin43而促進動脈粥樣硬化發生發展。因此本研究對ox-LDL是否可影響體外培養的臍靜脈內皮細胞connexin43的表達作一探索。

材 料 和 方 法

1材料

RPMI-1640細胞培養液、胰酶、PBS液、胎牛血清購自上海澤衡生物公司。內皮細胞株購自南京凱基生物公司。Trizol 和 RT-PCR試劑盒購自Invitrogen。Ox-LDL購自上海日初生物科技有限公司。Connexin43引物對和GAPDH引物對由上海澤衡生物公司合成。兔抗人connexin43多克隆抗體購于Abcam(Catalog Number: ab62689)。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體、山羊血清、C液購自北京中杉金橋生物科技有限公司。Triton X-100購自上海生工。DAB顯色液購自福州邁新生物技術開發有限公司。

2內皮細胞培養及ox-LDL的干預

購買的人臍靜脈內皮細胞株常規傳代，接種于6孔板培養基，待內皮細胞長至約80%滿后換液，對照組繼續以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養，而另外3組則在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中分別加入不同濃度的ox-LDL，使ox-LDL的終濃度分別為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。繼續培養24 h后，去除培養液，PBS液沖洗2遍后，加入Trizol 2 mL，常規提取各組的總RNA，-20 ℃條件下保存。

3RT-PCR檢測connexin43mRNA表達

提取的各組RNA通過紫外分光光度計測定260和280 nm處吸光度值,計算RNA純度和濃度。按逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA第1鏈,再進行PCR擴增。用Premier 5.0軟件設計PCR引物對，connexin43的PCR引物序列為上游 5’-GAGCGGATACAGAGGAGGA-3’,下游 5’-CTCCACCCATCTACCCCATAC-3’。內參GAPDH的引物序列為上游 5’-CGTGAAAGATGTCGTGGAA - 3’，下游5’-TGGAAGATGGTGATGGGAT-3’。Connexin43 PCR擴增條件為：95 ℃ 5 min 1循環，之后95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環，最后72 ℃ 10 min 1循環，產物長度為383 bp；內參GAPDH PCR擴增條件為：95 ℃變性5 min 1循環，之后95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32個循環，最后72 ℃ 10 min 1循環，產物長度為223 bp。PCR反應體系為20 μL體系。PCR反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳判斷結果，Bio-Rad成像系統拍攝照片用于分析。

4免疫細胞化學檢測connexin43蛋白的表達

4.1細胞爬片和ox-LDL的干預 傳代后的內皮細胞按2×107cells/L濃度接種于含有載玻片的6孔板培養基，分為對照組和100 mg/L ox-LDL干預組，干預組設3復孔，待細胞生長至鋪滿約90%玻片后換液，對照組繼續以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液培養，而干預組則在培養液中加入100 mg/L(終濃度)的ox-LDL,兩組均繼續培養24 h后去除培養液，PBS液沖洗2遍后進行免疫細胞化學檢測。

4.2免疫細胞化學染色 (1) PBS清洗標本 3次 各 1 min。(2)4%多聚甲醛固定 20 min。(3)空氣干燥 5 min。(4)PBS清洗標本 3次各 2 min。(5)0.5% Triton X-100(DPBS配) 孵育1次 20 min。(6 )PBS清洗標本 3次 各 2 min。(7)3%H2O2孵育15 min。(8)DPBS清洗標本 3次各2 min。(9)山羊血清封閉20 min。(10)兔抗人connexin43抗體孵育(PBS配，滴度1∶200，濕盒)37 ℃ 60 min。(11)PBS清洗標本 3次 各 5 min。(12)Ⅱ抗工作液孵育(濕盒) 37 ℃ 30 min。(13) PBS清洗標本 3次 各 5 min。(14)C液(濕盒) 37 ℃ 30 min。(15)PBS清洗標本 3次 各 5 min。(16)DAB顯色(避光，鏡下觀察至棕色 ) 約3-10min。(17)蒸餾水洗 2次 1 min。(18)蘇木素復染 1 min后自來水沖洗。

4.3結果判斷 每張切片隨機連續觀察5個高倍視野(×200),每處視野計數100個細胞: (1)各視野中陽性細胞率作為該切片的陽性細胞率進行計分。(2)染色強度以多數陽性細胞呈現的染色特征作為標準計分。具體計分方法按Formowitz評分法[5], 據染色程度(淺、中、深)及范圍分別計分：細胞無著色記為0分，細胞輕度著色呈淡黃色記為1分，細胞著色呈棕黃色記為2分，細胞明顯著色呈棕褐色記為3分；染色范圍：<5%記分0分，5%-25%記為1分，25%-50%記為2分，>50%記為3分，將陽性細胞率和染色強度計分之和作為總分進行結果判定。結果分為4個等級: 0-1分為-， 2-3分為+，4-5分為++，6-7分為+++。

5統計學處理

運用ImageJ 1.43圖像分析軟件對mRNA電泳圖片進行灰度掃描半定量分析。運用SPSS 14.0統計軟件包進行數據統計分析。mRNA電泳圖片采用各組connexin43條帶與其GAPDH條帶的灰度比值作為統計變量，采用t檢驗分析；免疫細胞化學結果按照染色強度等級采用Wilcoxon秩和檢驗分析。雙側P<0.05認為差異顯著。

結 果

1不同濃度的ox-LDL對內皮細胞connexin43mRNA表達水平的影響

不同濃度(50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)的ox-LDL干預24 h后引起內皮細胞connexin43 mRNA的表達水平增加，且呈濃度依賴性的改變，隨著ox-LDL濃度的增加，connexin 43 mRNA表達水平的增加更加明顯，見表1、圖1。

Figure 1. The changes of connexin43 mRNA expression level in HUVECs after intervention of different concentrations(50 mg/L,100 mg/L and 200 mg/L)of ox-LDL.

圖1不同濃度(50mg/L、100mg/L和200mg/L)ox-LDL刺激后內皮細胞connexin43mRNA表達水平

表1不同濃度ox-LDL干預后對HUVECsconnexin43mRNA表達的影響

GroupGrayvalueratioControl0．700±0．01350mg/Lox-LDL0．900±0．013??100mg/Lox-LDL0．980±0．007??200mg/Lox-LDL1．010±0．004??

**P<0.01vscontrol group.

2Ox-LDL干預內皮細胞后對connexin43蛋白表達的影響

如圖2所示，免疫細胞化學染色結果顯示，2組細胞形態無明顯差異，且均有connexin 43蛋白的表達。正常對照組內皮細胞中僅見較弱的connexin 43蛋白陽性染色，呈淡黃色，以+、++為主。而100 mg/L ox-LDL干預24 h后connexin 43蛋白陽性染色明顯加深，呈棕褐色顆粒狀，以++、+++為主，與正常對照組相比，100 mg/L ox-LDL干預24 h后connexin 43蛋白表達明顯增強，差異顯著(P<0.01，見表2。

Figure 2. The results of immunocytochemical staining. A: control group, a light yellow staining on the surface of endothelium cell could be seen; B: 100 mg/L ox-LDL intervention group, after intervention for 24 h with 100 mg/L ox-LDL, the staining on the surface of endothelium cell was denser, and the brown cytoplasm staining of endothelium cells was found.

圖2免疫細胞化學染色圖片

表2100mg/Lox-LDL干預24h后connexin43蛋白表達水平變化

Table 2. The changes of connexin43 protein expression level 24 h after intervention of 100 mg/L ox-LDL(n=6)

GroupCellstainingintensity-++++++Control0240100mg/Lox-LDL0015??

**P<0.01vscontrol group.

討 論

組成縫隙連接的蛋白亞單位稱為connexins，現已發現人類有20種以上的connexins亞型，其中connexin43在人類主要表達在血管內皮細胞、平滑肌細胞和心肌細胞，研究表明connexin43在動脈粥樣硬化的發生、發展中起著重要作用。Blackburn等[6]研究發現人類冠狀動脈粥樣硬化的早期，其增厚的內膜中(平滑肌細胞間)縫隙連接蛋白connexin43表達明顯增強。Kwak等[7]研究表明通過connexin43基因半敲除的LDL受體基因缺陷的小鼠(LDLR-/-Cx43+/-)與LDL受體基因缺陷的帶有正常connexin43基因的小鼠(LDLR-/-Cx43+/+)相比，其connexin43蛋白表達減少，喂養高膽固醇飼料14周后其胸腹主動脈和主動脈根部動脈粥樣病變比LDLR-/-Cx43+/+減少50%(P<0.01)；LDLR-/-Cx43+/-小鼠與LDLR-/-Cx43+/+小鼠相比，其粥樣斑塊中含更少的炎癥細胞，有更厚的纖維帽，含更多的膠原和平滑肌細胞；同時發現，他汀類調脂藥能減少人類血管細胞connexin43的表達，而他汀類藥物的抗動脈粥樣硬化作用可能也與此有關。這些結果減少connexin43的表達能減輕動脈粥樣硬化，提示connxin43在動脈粥樣斑塊的形成中起著關鍵的作用。國內Wang等[8]研究表明洛伐他汀能減少兔主動粥樣硬化斑塊中connexin43和connexin40的表達。Gabriels等[9]觀察到connexin43在血管內皮主要分布在血流紊亂的部位，如血管分叉的開口處，這些部位異常的切應力使內皮細胞connexin43的表達增高，同時這些部位也是動脈粥樣斑塊的好發部位。Dai等[10]模擬斑塊易感和抵抗區域的動脈波型，應用于培養的內皮細胞，對其表型進行了觀察，結果發現斑塊易感波形引起connexin43表達上調，而斑塊保護波形則與connexin37的水平升高有關。Chadjichristos等[11]等研究表明connexin43基因半敲除的LDL受體基因缺陷的小鼠(LDLR-/-Cx43+/-)球囊損傷頸動脈內膜后其新生內膜的厚度比LDLR-/-Cx43+/+的小鼠減小，巨噬細胞浸潤也更少，這可為PCI術后再狹窄的防治提供一新的靶點。總之，目前的研究提示內皮connexin43可能具有促動脈硬化作用。

眾所周知，氧化低密度脂蛋白在動脈粥樣硬化的發生發展中起著關鍵的作用[2]，ox-LDL可以通過多種機制促進動脈粥樣硬化的發生發展。ox-LDL能誘導血管內皮細胞多種炎癥因子的表達增加[12]，而動脈粥樣硬化已被認為是一種慢性炎癥的過程。因此我們設想作為動脈粥樣硬化發病機制關鍵因素的ox-LDL是否能影響內皮細胞connexin43的表達而參與動脈粥樣硬化的發生發展呢？據我們所知，目前國內外尚未見這方面的研究報道，因此是一個值得研究的靶點。本實驗用ox-LDL干預體外培養的人臍靜脈內皮細胞，以觀察ox-LDL能否影響人臍靜脈內皮細胞connexin43的表達。結果發現不同濃度(50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)的ox-LDL能濃度依賴性地引起內皮細胞connxin43 mRNA的表達增加；免疫細胞化學的檢測結果則提示，100 mg/L ox-LDL干預內皮細胞24 h后可引起connexin43蛋白的表達水平增加。這些結果提示ox-LDL干預內皮細胞后可引起縫隙連接蛋白connexin43 mRNA和蛋白的表達增加，從而促進動脈粥樣硬化的發生發展。本研究結果支持內皮connexin43具有促動脈粥樣硬化作用的觀點。

至于ox-LDL引起內皮細胞connexin43表達增加的機制尚有待于進一步研究明確。本研究結果表明ox-LDL能引起內皮細胞connexin43 mRNA和蛋白的表達水平均增高，提示ox-LDL在轉錄水平引起connexin43基因的表達上調。目前研究表明，人類connexin43基因的轉錄調控涉及轉錄因子Sp1、Sp3、AP1、Nkx2.5、Tbx2等，此外，幾條信號通路也參與了connexin43的轉錄調控，如PKC信號通路、Wnt信號通路和dibutyryl-cAMP信號通路等[13]。而Akiba等[14]研究表明在大鼠系膜細胞中ox-LDL能激活轉錄因子Sp1。因此推測，ox-LDL可能通過激活內皮細胞轉錄因子Sp1進而啟動connexin43基因的轉錄，引起connexin43的表達增加。當然，ox-LDL更可能通過其它信號途徑或者影響其它轉錄因子的活性而導致內皮細胞connexin43表達的增強，尚有待于進一步研究明確。

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EffectofoxidizedLDLonexpressionofconnexin43inculturedhumanumbilicalveinendothelialcells

ZHANG Shun-rong, HONG Ming-ming, GAO Yue, WANG Xiao-nan, FENG Fei

(DepartmentofGerontology,HangzhouFirstPeople’sHospital,Hangzhou310006,China.E-mail:zsr8888@126.com)

AIM: To investigate the effect of oxidized LDL (ox-LDL) on the expression of gap junction protein connexin43 in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)invitro.METHODSHuman umbilical vein endothelial cells cultured in normal condition were divided into blank control group, 50 mg/L,100 mg/L and 200 mg/L ox-LDL intervention groups. The mRNA expression of connexin43 in cultured HUVECs was detected with RT-PCR method; while the protein level of connexin43 was determined by the method of immunocytochemistry in the control and 100 mg/L ox-LDL intervention groups 24 h after ox-LDL was given.RESULTSDifferent concentrations (50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L) of ox-LDL up-regulated mRNA expression of connexin43 in cultured HUVECs after 24 h intervention (P<0.01). The protein level of connexin43 in cultured HUVECs intervened with 100 mg/L Ox-LDL for 24 h was up-regulated as compared to the control cells (P<0.01).CONCLUSIONOx-LDL may up-regulate the expression of connexin43 at mRNA and protein levels in cultured human umbilical vein endothelial cells within short time, indicating that connexin43 plays an important role in the pro-atherosclerotic effect of Ox-LDL.

Connexin43; Lipoproteins,LDL; Human vein endothelial cells

R541.4

A

1000-4718(2011)03-0589-04

2010-09-06

2010-10-26

浙江省醫藥衛生科技計劃資助項目(No.2008B145)

△通訊作者 Tel:0571-87065701-21882； E-mail: zsr8888@126.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.033