c-Jun氨基末端激酶在腦缺血再灌注損傷中的作用*

劉莎莎, 高維娟

(承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

c-Jun氨基末端激酶在腦缺血再灌注損傷中的作用*

劉莎莎, 高維娟△

(承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

在生物體內，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是信號從細胞表面轉導至細胞核內部的重要傳遞者，是一類絲/蘇氨酸殘基的蛋白激酶。目前在真核生物細胞中，已明確了4條MAPK信號轉導通路[1]，即細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinases，ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路、p38通路及ERK5通路。JNK信號通路作為MAPK信號通路中重要的通路之一，參與了多種生理、病理過程，目前諸多研究表明其在腦缺血/再灌注損傷過程中尤其是程序性細胞死亡過程中起著重要的調控作用[2]，本文就近年來對JNK通路的研究及JNK在腦缺血再灌注誘導的細胞凋亡中的作用及機制作一綜述。

1 JNK信號通路概述

1.1JNK及編碼JNK的基因 JNKs家族是1990年發現的MAPKs家族成員之一，屬于進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在脊椎動物，編碼JNK的基因包括jnk1、jnk2和jnk3[3，4]，其相應的編碼產物JNK1和JNK2在各種組織細胞中廣泛表達，而JNK3則僅在腦、心臟、睪丸等組織中表達[5]。這3種JNK基因都能編碼46 kD和54 kD 2種蛋白產物[6]，它們通過不同的剪接及不同的外顯子形成了10種不同的JNK剪接變體，這10種不同的剪接變體亞型均含有“Thr-Pro-Tyr (TPY)”這一特征性模塊結構[7]。

1.2JNK的上游激活物和下游分子 JNK通路作為 MAPK信號通路之一也符合多級蛋白激酶的級聯反應，其中包括3種關鍵的激酶：MAPK、MAPK的激酶(MAPKK)和MAPK激酶的激酶(MAPKKK)。MAPKKK對MAPKK的絲氨酸、蘇氨酸雙位點磷酸化而將其活化；進而MAPKK對MAPK進行絲氨酸、蘇氨酸雙位點磷酸化活化[8]。JNK的上游激酶是MKK4和MKK7。目前發現的MAPKKK至少有20種，其中至少有14種能夠激活MKK4/MKK7-JNK/MAPK通路[3]，主要包括MAPK/ERK激酶的激酶(MEKK1、2、3、4)、凋亡信號調節激酶(apoptosis signal-regulating kinases, ASK)、混合連接激酶(mixed lineage kinase, MLKs)和TGF-β激活的蛋白激酶(TGF-β-activated protein kinases, TAK)等。JNK最初被發現是一種特異性磷酸化核內轉錄因子c-Jun的激酶，并因此被命名為c-Jun氨基末端激酶，隨后發現其它一些核內轉錄因子如Ets-like protein 1 (Elk-1)、激活轉錄因子2 (activating transcription factor 2，ATF2)、DPC4、激活T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT4)以及ets-2等也是其下游底物，但一直對JNK的胞漿底物知之甚少。近年來一些研究顯示胞漿中的某些成分(如細胞骨架蛋白)可能也是其作用底物。此外，He等[9]研究還發現角蛋白8及角蛋白18分子上均含有c-Jun、ATF-2等分子上決定JNK作用特異性和效率的特定錨著點，免疫共沉淀實驗也表明JNK能夠與角蛋白8/18直接結合，因此角蛋白8/18是一個新的JNK胞漿靶分子。此類JNK胞漿底物的發現具有重要的病理生理意義，它表明JNK信號通路的激活不僅具有調節核內基因表達的作用，還可能通過影響胞漿底物分子的結構與功能而直接、迅速地發揮其生物學效應。

1.3JNK信號通路的激活 JNK信號通路可被應激刺激(如紫外線、熱休克、高滲、缺血再灌注等)、細胞因子(TNF-α、IL-1)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)及某些G蛋白偶聯受體激活。細胞外刺激可通過Ras依賴或非Ras依賴的2條途徑激活JNK；小分子G蛋白Ras超家族的成員之一Rho可能也是JNK激活的上游信號[10]。Rho蛋白Rac可能是與p21激活的絲/蘇氨酸激酶(p21-activating kinase，PAK)結合，使其自身磷酸化而被激活，活化的PAK進一步使JNK激活。激活的JNK經過核轉位，可激活核內轉錄因子如c-Jun、Jun-B、Elk-1、DPC4等，再調節轉錄因子的靶基因如及早基因、后期效應基因和熱休克基因等的表達，促進有關蛋白的合成和通道的改變，完成對細胞外刺激的反應。

2 JNK信號通路在腦缺血再灌注損傷中的作用

2.1JNK與神經細胞凋亡的關系及相關機制 在大鼠嗜鉻細胞瘤PC-12的培養過程中，去除神經生長因子(nerve growth factor, NGF)，JNK和p38持續激活，ERKs的活性被抑制，PC-12細胞發生凋亡。而用反義轉染特異地抑制JNK和p38的激活，可阻止細胞凋亡的發生，從而在神經元中首次發現了JNK的促凋亡作用[11]。另外敲除jnk3基因的小鼠能抵抗興奮毒性谷氨酸受體激動劑紅藻氨酸(kainic acid)誘導的癲癇發作反應和海馬神經元興奮毒性凋亡，同時伴有c-Jun磷酸化和轉錄激活蛋白(activator protein-1，AP-1)轉錄活性的明顯減低，也說明JNK信號通路參與了細胞凋亡。

近期，諸多動物模型的研究也證實了JNK信號通路參與了腦缺血再灌注后的神經細胞凋亡，并對JNK通路介導細胞凋亡的相關機制進行了探討。腦缺血再灌注后神經元凋亡是一個極其復雜的過程，細胞凋亡的內源性路徑(又稱線粒體凋亡途徑)和外源性路徑(又稱死亡受體途徑)均參與了腦缺血后神經元的凋亡過程。JNK信號通路通過調控線粒體途徑和死亡受體途徑在腦缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡中起重要作用[12],見圖1。(1)線粒體途徑： 腦缺血再灌注期間應激反應、缺血缺氧、自由基、興奮性氨基酸以及鈣超載等多種刺激因素可激活JNK通路的關鍵激酶，即MAPK/ERK激酶類的MKK4、MKK7和MAPK/ERK激酶的激酶類的MEKK1、2、3、4。最終導致JNK三肽區的酪氨酸與蘇氨酸雙磷酸化，從而使其活化并轉移到細胞核[13]。激活的JNK通過刺激其下游底物改變線粒體通透性轉換孔(permeability transition pore，PTP)的通透性，促使細胞色素C(cytochrome C, Cyt C)釋放入胞漿，Cyt C由線粒體釋放出后，與胞漿的凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor-1, Apaf-1)以及caspase-9前體(pro-caspase-9)結合，在ATP存在條件下形成“凋亡體”復合物(Cyt C+Apaf-1+pro-caspase-9)，并由此激活caspase-9[14]，活性caspase-9裂解并激活caspase-3，caspase-3激活后一方面直接作為蛋白酶直接降解底物，另一方面激活其它的caspase蛋白酶類，如caspase-6、caspase-7等，共同參與底物的降解，它們是凋亡的直接執行者。細胞凋亡的特征性形態學變化，如染色體凝聚和DNA片段化等，均與caspase-3的降解作用直接相關[15]。Okuno等[16]利用大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occulsion,MCAO)模型，檢測到腦缺血后60 min MCA區JNK活性及磷酸化的JNK增加；通過TUNEL 染色及凋亡相關DNA 片段分析，發現JNK特異性抑制劑SP600125可阻斷細胞凋亡因子Bax從胞漿轉入線粒體，并進一步探討，推測JNK是通過刺激其可能的下游底物BimL，從而將信號轉到Bax，Bax可引起線粒體通透性改變，釋放Cyt C，釋放的Cyt C和胞漿蛋白Apaf-1結合，引起Apaf-1寡聚，激活caspase-9，進一步激活caspase-3，最終導致細胞凋亡。(2)死亡受體途徑：外源性凋亡路徑與細胞表面死亡受體激活有關，也稱為死亡受體路徑。細胞表面死亡受體屬于TNF受體家族，包括TNF受體-1(tumor necrosis factor receptor-1，TNFR-1)、Fas受體和p75神經營養素受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)。JNK通過磷酸化c-Jun和ATF-2激活轉錄因子AP-1(AP-1是Jun-Jun、Jun-Fos或Jun-ATF的二聚體)[17]，從而進一步促進多種促凋亡蛋白的表達，如p53、Bax、FasL、TNF等。例如，Fas配體與Fas受體結合，這一結合觸發了胞內Fas相關性受體蛋白死亡結構域(Fas -associated death domain protein，FADD)的募集。FADD的N末端包含有死亡效應區域，能與caspase-8前體的死亡效應區域結合，從而形成“FasL Fas FADD procaspase-8”復合結構，這一復合結構被認為是死亡誘導信號復合物，能催化caspase-8前體反式激活，導致自身裂解，形成并釋放活性caspase-8[18]。活性caspase-8從復合物中釋放出來進入胞漿，其既可以直接裂解激活下游的caspase-3，也可間接方式通過線粒體依賴性機制激活caspase-3，最終導致凋亡。

Figure 1. Mechanism of JNK-mediated neuronal apoptosis in brain ischemia reperfusion injury.Different extracellular stimuli can activate the JNK signalling pathway.The activated JNK mediates neuronal apoptosis in cerebral ischemia/reperfusion-induced brain injury through controlling both the death receptor pathway and the mitochondrial-dependent pathway.

圖1JNK介導腦缺血再灌注后細胞凋亡機制

目前JNK在腦缺血再灌注過程中是否參與損傷DNA的修復功能越來越受到人們的關注。最近研究發現[19]建立大鼠全腦缺血再灌注模型后，腦缺血區p-JNK表達上調，DNA修復蛋白XRCC1和Ku70 表達下調， JNK抑制劑SP600125可減少p-JNK的表達，并使XRCC1和Ku70表達上調，減輕了全腦缺血再灌注損傷，DNA的修復功能得到改善，提示JNK可使全腦缺血再灌注大鼠海馬神經元DNA修復功能受損，導致細胞凋亡，其機制可能與下調DNA修復蛋白XRCC1和Ku70的表達有關。全腦缺血再灌注時，大量的DNA受到損傷使細胞進入DNA合成期(S期)，損傷的DNA開始進行修復，一旦修復失敗則導致神經元凋亡。XRCC1 是一種DNA修復蛋白，在堿基切除修復中起整體支架作用，對氧化劑導致的DNA單鏈斷裂和堿基損傷修復起重要作用[20]Ku70是DNA依賴蛋白激酶的催化亞單位，能夠啟動DNA雙鏈的修復過程。研究表明，XRCC1和Ku70表達下調先于DNA斷裂的發生。全腦缺血再灌注大鼠大量DNA斷裂與細胞凋亡有關，XRCC1和Ku70表達下調是DNA斷裂無法修復的機制之一。然而，JNK下調XRCC1和Ku70表達的具體分子機制仍有待進一步探討。

2.2JNK與非神經細胞凋亡的關系 在腦缺血再灌注過程中，非神經元性細胞和神經元都處于缺血缺氧的環境中，因而理論上非神經元性細胞和神經元一樣也可發生缺血再灌注損傷，包括凋亡和壞死。腦組織中非神經元性細胞包括構成血管的細胞(如血管內皮細胞)、浸潤的炎性細胞、神經膠質細胞等。目前大部分的研究并未將缺血后受累腦組織區域可能存在的非神經元性細胞的凋亡從神經元凋亡中區分開來。事實上，已經有越來越多的研究明確了腦缺血后非神經元性細胞凋亡的存在。Lennmyr等[21]在大鼠MCAO模型中采用免疫組化方法發現缺血后活化的JNK未在神經元中表達，僅在損傷側的動脈血管和膠質細胞中出現，提示JNK可能參與了腦缺血再灌注后的非神經源性細胞凋亡。另有研究報道[22]大鼠大腦中動脈閉塞后星形細胞和小膠質細胞caspase-3和其它多種caspase蛋白水平都上調了。JNK信號通路介導的非神經元性細胞凋亡的研究資料目前仍然較少，其機制是否與神經元細胞凋亡機制一致尚無足夠證據，其在腦缺血再灌注后神經系統損傷及預后中的重要性應當逐漸受到重視。

3 總結與展望

大量研究表明JNK信號通路參與了腦缺血再灌注后神經細胞的凋亡，抑制JNK通路可保護神經元免受損傷。但是Yun等[23]報道，JNK通路在抗凋亡過程中起到了重要的作用，其機制與激活蛋白酶活化受體-1(protease-activated receptor-1,PAR-1)從而使神經細胞免受毒素的損傷有關。且最新研究表明[24]腦缺血再灌注后JNK/c-Jun/AP-1通路可引起14-3-3-γ表達上調，而14-3-3 -γ表達上調可抑制腦缺血再灌注引起的神經細胞凋亡，說明JNK信號通路可間接起到神經細胞保護作用。另有研究表明JNK在腦缺血再灌注損傷過程中具有雙向作用，缺血早期JNK的激活促進細胞生存，而晚期JNK的激活則導致神經細胞的凋亡。然而諸多實驗卻仍表明腦缺血再灌注后JNK/c-Jun/AP-1通路的激活與細胞凋亡有關。目前對JNK通路在腦缺血再灌注損傷中到底是起到促凋亡還是抗凋亡作用還存在爭議，但毋庸置疑，JNK通路在各種原因引起的腦缺血再灌注損傷機制中起著重要的作用。因此，JNK通路的組成及調節機制為相關疾病的治療提供了潛在的治療靶點。

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Roleofc-JunN-terminalkinaseinbrainischemiareperfusioninjury

LIU Sha-sha, GAO Wei-juan

(DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China.E-mail:gwj6088@163.com)

c-Jun N-terminal kinase (JNK), a member of the mitogen-activated protein kinase family, is activated in response to a number of extracellular stimuli, including inflammatory cytokines, UV irradiation and ischaemia. A large amount of evidence supports the key role for JNK signaling in stress-induced apoptosis. Recent studies suggest that JNK signaling pathway is involved in neuron death by controlling both the death receptor pathway and the mitochondrial-dependent pathway after transient ischemia. The role of the JNK signaling pathway in brain ischemia reperfusion injury is overviewed in this article.

JNK通路； 信號轉導； 腦缺血再灌注； 細胞凋亡

JNK pathway; Signal transduction; Brain ischemia reperfusion; Apoptosis

R363

A

1000-4718(2011)03-0607-04

2010-06-09

2010-10-16

教育部新世紀優秀人才支持計劃資助項目(No.NCET-06-0258);河北省自然科學基金重點資助項目(No.C2006000865)

△通訊作者 Tel:0311-85110168；E-mail:gwj6088@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.038