激光多普勒血流儀評價活體大鼠大腦中動脈栓塞模型成功的可行性分析*

劉 宇， 孟 然△， 閆 峰， 羅玉敏， 吉訓明△

(1北京大學第九臨床醫學院，北京世紀壇醫院神經內科，北京 100038； 2首都醫科大學宣武醫院腦血管病研究所，北京 100053)

·實驗技術·

激光多普勒血流儀評價活體大鼠大腦中動脈栓塞模型成功的可行性分析*

劉 宇1， 孟 然1△， 閆 峰2， 羅玉敏2， 吉訓明2△

(1北京大學第九臨床醫學院，北京世紀壇醫院神經內科，北京 100038；2首都醫科大學宣武醫院腦血管病研究所，北京 100053)

目的探討激光多普勒血流儀(LDF)評價活體大鼠腦缺血/再灌注損傷模型制作成功的可行性和可靠性分析。方法10只體重280-310 g的雄性SD大鼠用傳統線栓法制作單側大腦中動脈阻塞(MCAO)模型，神經功能評分，LDF監測插栓前后大鼠腦血流動態變化。于缺血2 h和再灌注24 h斷頭取腦，TTC染色檢測腦片梗死灶體積。結果基線血流均值為(224.99±75.00)PU, 局灶神經功能障礙評分0分。插栓成功MCAO模型，缺血2 h血流均值為(67.23±6.90)PU, 與基線血流差值為157.76PU，降幅約為70%(P<0.01)，差異顯著。拔拴后血流均值為(216.01±7.30)PU，與缺血2 h血流差值為148.78PU(P<0.01)，差異顯著；與基線血流差值為-8.98PU(P>0.05)，無顯著差異。再灌注24 h后，局灶神經功能障礙評分10.35分，腦片TTC染色顯示梗死及水腫灶。插栓不成功模型LDF監測顯示仍有血流通過，降幅少于基線的50%，再灌注24 h后，局灶神經功能障礙評分0分，TTC染色未見梗死灶。結論LDF對大鼠腦血流的監測是除神經功能評分以外另一種判斷活體大鼠MCAO模型制作成功的可靠而實用的方法。

模型,大腦中動脈阻塞; 激光多普勒血流儀

1975年Ster首次報道了用激光多普勒血流測定法(laser Doppler flowmetry, LDF)監測皮膚血流量。1987年Rosenblum將LDF用于神經外科術中腦皮質血流量測定。激光多普勒血流監測是一種實時動態、微創和敏感的微循環血流監測技術，不僅用于神經外科術中對局部腦血流量(regional cerebral blood flow,rCBF)的監測[1]，自90年代起也用于監測rCBF的實驗研究。

大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的制作已經成熟[2-9]，但對活體成功模型的評判標準尚欠客觀，目前國內對活體大鼠模型成功與否的評價仍無明確客觀的標準，多以大鼠麻醉清醒后出現插栓對側前肢不能前伸、運動旋轉追尾等表現評價，具有一定的主觀性。能否利用客觀可行的方法提高對模型成功與否評價的客觀性？ Schmid-Elsaesser等[2]用LDF評價MCAO模型，發現持續腦血流監測可以用來證明模型制作是否成功，并認為動態血流監測對發現術中出現的蛛網膜下腔出血高度敏感。因此本實驗擬通過應用LDF監測大鼠MCAO模型制作過程中大鼠腦血流的動態變化，評價實時動態腦血流監測對大鼠MCAO模型制作成功與否評價的價值。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑與儀器 TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑，科海軍舟生物技術公司)、10%水合氯醛(首都醫科大學宣武醫院)、激光多普勒血流儀(Perimed；PF5001型；瑞典)、手術顯微鏡(Carl Zeiss)、反饋式溫度調節儀(Harvard Apparatus) 、線栓(北京沙東技術有限公司；型號2838-A)。

1.2動物 SPF級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠10只，體重280-310 g，由維通利華實驗動物有限公司提供，動物許可證為SCXK(京)2006-0009。

2方法

2.1模型制作 參照改良線栓法制作MCAO模型[10，11]，大鼠稱重后，用10%水合氯醛350 mg/kg，腹腔注射麻醉，大鼠俯臥，頭部備皮，矢狀位剪開額頂部皮膚2 cm，暴露皮下筋膜，用浸滿雙氧水的棉簽摩擦暴露的筋膜，直至暴露出顱骨前囟及右側半顱骨，應用立體定位儀以前囟為起點向右5 mm，向后3 mm，在該處用牙科鉆打孔，至穿透顱骨但未打破硬腦膜為宜。將激光多普勒血流儀的探頭固定于孔上，開始記錄右側大腦中動脈供血區域血流變化值，當所示數值平穩，開始制作MCAO模型。頸部備皮，正中剪皮開口，鈍性分離腺體和筋膜，術中小心分離右側頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)，電凝ECA上的2個小分支，將ECA近頭端結扎并剪斷，近心端緊貼分叉處穿線打松結，于CCA和頸內動脈(ICA)上各置一動脈夾，然后用顯微剪在ECA游離端剪一小口，將線栓由此插入動脈，去除ICA上的動脈夾，將線栓慢慢插入ICA，當激光多普勒血流儀顯示腦血流量下降至基礎值的20%-30%時停止插栓[1]，將松結系緊，去除CCA上的動脈夾，縫合皮膚。缺血2 h，拔栓，血流恢復至基線為模型成功。

2.2神經功能評分 采用12分評分法[12-14]。 (1)提尾懸空試驗：無明顯神經功能缺失為0分，梗死對側肢體屈曲為1分，梗死對側肢體外展為2分。(2)肢體放置試驗：(a)視覺試驗(前方)：實驗者將動物握于手中，使其前爪懸空，自桌面上方向桌面緩慢斜線靠近此時桌子位于大鼠前方，正常大鼠反應為前肢即刻抓向桌面，損傷大鼠則表現為肢體反應延遲。正常為0分；反應延遲但不超過2 s為1分；反應延遲且超過2 s為2分。(b)視覺試驗(側方)，此時桌子位于動物側方,其余實驗方法及評分標準同前。(c)觸覺試驗(前方)，將動物雙眼遮住，并使其前爪懸空，此時大鼠應該既看不見，也不能用胡須觸及桌面，用其前爪背側輕觸桌面，刺激深度僅達到皮膚和毛發。動物反應及評分同視覺實驗。(d)觸覺試驗(側方)評分同前。(e)本體覺試驗，按壓動物前爪，刺激深達肌肉及關節，評分同前。

2.3腦梗死體積的測定 大鼠缺血2 h，再灌注24 h后斷頭取腦，將鼠腦放在連續模具內進行冠狀等距切片，片厚約2 mm，共切6片，用TTC染色，多聚甲醛固定，數碼相機攝片。使用Image-Pro Plus軟件，計算腦梗死體積[13,15]。梗死體積百分率=(正常側大腦半球體積-梗塞側非梗塞區腦組織體積)/正常側大腦半球體積。

2.4腦血流監測 用Perimed公司提供的LDF數據記錄軟件(PSW)，記錄并分析監測期間腦血流變化情況。

3統計學處理

結 果

1LDF監測MCAO模型的腦血流圖

MCAO模型成功的大鼠插栓時腦血流降幅距基線達到70%以上(圖1)，且拔栓后血流迅速恢復接近基線，模型成功率為88%。成功的MCAO模型更多的腦血流圖特點見圖1。有1只麻醉意外，被排除。有1只出現缺血期間局部血流不能完全阻斷，腦血流平均降幅僅達到基線的50%，見圖2，此時線栓已插入深度達18 mm且線栓插入和拔出均困難，血流阻斷不完全的腦血流圖特點見圖2。

如圖1顯示，區域1為基線，此階段是制作大腦中動脈缺血模型的過程，手術中碰觸血管時有血流波動情況發生，基線平均血流值為(224.99±75.00)PU。區域2為缺血階段，第一個標簽表示，將線栓插入大腦中動脈，此時血流量迅速降低，下降幅度約為基線區域的70.12%，插線后平均血流值為(67.23±6.90)PU。區域3為再灌注的起始階段，第2個標簽表示，將線栓拔除后，血流迅速恢復至基線水平，拔栓后平均血流值為(216.01±7.30)PU，恢復至基線血流的96.10%。

Figure 1. Dynamic changes of cerebral blood flow during MCAO (successful).Horizontal axis: time(min); vertical axis: the relative value of blood flow (PU).Area 1: baseline=(224.99±75.00)PU;Area 2: cerebral blood flow after filament inserted =(67.23±6.90)PU;Area 3: restored cerebral blood flow after filament removed =(216.01±7.30)PU.

圖1MCAO過程中血流動態變化(成功)

Figure 2. Dynamic changes of cerebral blood flow during MCAO (unsuccessful).Horizontal axis: time (min); vertical axis: the relative value of blood flow (PU).

圖2MCAO過程中血流動態變化(不成功)

如圖2及表1所示,在缺血期間，插栓局部血管呈現不規則的收縮狀態。最大血流為177.34 PU，最小值為57.01 PU，均值為99.67 PU，標準差為22.62，血流呈蠕動樣波動，雖變化幅度較顯著，但插栓后降幅不超過基線的50%，也不體現明確的插栓缺血/拔栓再灌注的規律。本圖所示的情況發生在缺血期間，可能為線栓在血管內有滑動，造成的非持續性阻斷血流；另有一些沒有完全阻斷血流的情況，發生在插栓的過程中，可能由于線栓刺激血管壁導致局部血管發生痙攣，此時線栓已不能再插入，過去常誤認為模型成功，只有經TTC染色方能排除。應用LDF持續動態腦血流監測，可以通過腦血流曲線的降幅及波動特點及時發現MCAO模型沒有成功。

2MCAO模型LDF監測腦血流動態變化數據

如表2所示，9只大鼠插栓后區域血流量平均值比基線區域下降幅度≥70%，拔栓后區域血流量平均值基本恢復至基線水平，無顯著差異,P>0.05。

3TTC染色驗證MCAO模型成功

于缺血2 h再灌注24 h后將大鼠斷頭取腦，冠狀等距切片制成腦片，TTC染色病理組織學驗證MCAO模型成功見圖3, TTC染色顯示的白色區域為新鮮梗死病灶。 本研究中模型成功大鼠的腦梗死平均體積為48.4%。24 h后神經功能評分平均值為10.35分。模型不成功,則沒有顯示白色的局灶梗死損害，見圖4。24 h后神經功能評分平均值為0分。

表1 血流變化數據(不成功)

表2 腦血流動態變化情況

*P<0.05vsbaseline.

Figure 3. Brain slices stained with TTC (2 h ischemia followed by 24 h reperfusion).

圖3TTC染色結果

Figure 4. Brain slices with TTC staining(Blood flow was blocked incompletely，without local infarction).

圖4TTC染色結果

討 論

國內以往對制作MCAO模型是否成功的評價主要依靠對動物存活時神經功能缺陷的評分，這種方法不完全可靠，常因摻雜主觀因素造成實驗評價誤差。MCAO模型制作過程中常會出現干擾評價模型是否成功的因素，如血管痙攣，此時雖然線栓已經不能再插入，但血流量下降程度遠沒有達到形成模型成功的標準，如果不使用腦血流監測，就此判斷模型成功，會使實驗出現假陽性的結果。另有一些大鼠造模成功后的臨床神經功能評分仍達不到入組標準，處死大鼠后才發現梗塞側腦梗死體積已經達標，產生假陰性結果，造成實驗中人力物力和時間的浪費。為提高對MCAO活體模型制作成功評價的準確性，我們在研究中嘗試使用LDF監測腦血流動態變化來評價MCAO活體模型制作是否成功。研究結果顯示：LDF監測結果與TTC染色證實了的腦梗死病灶具有很高的一致性，符合率達到88%。LDF監測評價比TTC染色評價更有優勢之處是前者不僅提高了對模型成功評價的準確性，同時可以對活體模型進行評價，為對同一MCAO活體模型梗死后再灌注的研究提供了可能。

另外LDF監測可以及時發現大鼠血管的個體差異，可以個體化選擇用于栓塞的栓子直徑，達到與血管腔直徑更好地吻合。有報道顯示[11]體重偏小的大鼠，血管管徑偏細，用同樣的線栓無法插入大腦中動脈，而體重稍大的大鼠血管管徑偏大，用同樣的線栓不能有效阻斷血流達到栓塞滿意的效果，對于實驗的可比性造成影響。而通過LDF血流量降低程度的監測來控制梗死體積，使每個MCAO模型更具有可比性。國外已采用激光多普勒血流儀評價MCAO模型是否成功[2]，而國內在模型制作上尚未見廣泛采用這一客觀的評價手段，影響實驗結果的可比性。本研究顯示，把腦血流監測作為評價模型是否成功的指標，不僅不需處死動物就能直接評價活體模型，而且可以提高MCAO模型的可比性，使實驗結果更有說服力。

激光多普勒血流測定法是一種準確反映微循環灌注的測量手段，在神經外科領域應用較多。臨床常用的另一種超聲經顱多普勒技術(TCD)主要用于判斷顱內較大血管的血流情況，間接反映血管功能及腦組織的灌注狀態，但無法探查腦組織微循環情況。將二者結合優勢互補，共同評價腦血流灌注狀態將會促進對缺血性腦血管動物模型的缺血/再灌注損傷整個過程中的每個不同病理階段的腦血管血流動力學的變化情況和藥物干預后的動態變化進行觀察。本研究結果再次證明LDF對于活體MCAO模型制作成功與否的評價是可靠而實用的。

(致謝:感謝首都醫科大學宣武醫院腦血管病研究所的閆峰老師及羅玉敏教授、吉訓明教授等對模型制作和應用LDF儀對動物模型腦血流監測等工作中提供的儀器、設備和技術指導。)

[1] 吳勁松，陳銜城. 激光多普勒血流測定法在局部腦血流量監測中的應用[J].國外醫學：腦血管疾病分冊,1999，7(3)：162-164.

[2] Schmid-Elsaesser R, Zausinger S, Hungerhuber E, et al. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry[J]. Stroke,1998, 29 (10):2162-2170.

[3] Zwagerman N, Sprague S, Davis MD, et al. Pre-ischemic exercise preserves cerebral blood flow during reperfusion in stroke[J]. Neurol Res,2010,32(5):523-529.

[4] Zweifel C, Czosnyka M, Lavinio A,et al. A comparison study of cerebral autoregulation assessed with transcranial Doppler and cortical laser Doppler flowmetry[J]. Neurol Res,2010, 32 (4):425-428.

[5] Livnat A, Barbiro-Michaely E, Mayevsky A. Mitochondrial function and cerebral blood flow variable responses to middle cerebral artery occlusion[J]. J Neurosci Methods,2010, 188 (1): 76-82.

[6] Hoyte LC, Papadakis M, Barber PA, et al. Improved regional cerebral blood flow is important for the protection seen in a mouse model of late phase ischemic preconditioning[J]. Brain Res,2006, 1121 (1):231-237.

[7] Harada H, Wang Y, Mishima Y, et al. A novel method of detecting rCBF with laser-Doppler flowmetry without cranial window through the skull for a MCAO rat model[J]. Brain Res Protoc, 2005,14 (3):165-170.

[8] Sch?ller K, Zausinger S, Baethmann A, et al. Neuroprotection in ischemic stroke-combination drug therapy and mild hypothermia in a rat model of permanent focal cerebral ischemia[J]. Brain Res,2004, 1023 (2): 272-278.

[9] Kim T, Masamoto K, Fukuda M, et al. Frequency-dependent neural activity, CBF, and BOLD fMRI to somatosensory stimuli in isoflurane-anesthetized rats[J]. Neuroimage,2010,52(1):224-233.

[10]Longa EZ, Weinstein RP, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1):84-91.

[11]戴 炯,文 立,熊文浩，等.改良線栓法制備大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型[J].上海交通大學學報(醫學版)，2007，10(10)：1218-1222.

[12]朱榆紅，吉訓明，李春艷，等.缺血后適應對大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響[J].中國病理生理雜志,2008，24(11)：2151-2155．

[13]Belayev L，Alonso OF,Busto R，et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture: Neurological and pathological evaluation of an improved model[J]．Stroke，1996，27(9)：1616-1623．

[14]Bederson JB, Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke,1986, 17(3): 472-476.

[15]Lin TN，He YY，Wu G，et al.Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats[J]．Stroke，1993, 24(1)：117-121.

EvaluationofratMCAOmodelbylaserDopplerflowmetry

LIU Yu1, MENG Ran1, YAN Feng2, LUO Yu-min2, JI Xun-ming2

(1DepartmentofNeurology,BeijingShijitanHospital,TheNinthClinicalMedicalCollegeofPekingUniversity,Beijing100038,China;2CerebrovascularDiseasesResearchInstitute,XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China.E-mail:victor65@126.com；E-mail:jixm70@hotmail.com)

AIM: To investigate the feasibility and reliability of using laser Doppler flowmetry (LDF) to evaluate the animal model of cerebral ischemia and reperfusion injuryinvivo.METHODSTen Sprague-Dawley (SD) male rats, weighing 280-310 g, were subject to unilateral middle cerebral artery occlusion (MCAO) with the routine method of line-embolism, and the cortical blood flow was continuously monitored by LDF during ischemia and reperfusion in the rats. Meanwhile, the degree of injury induced by cerebral ischemia and reperfusion was evaluated after MCAO by the nervous scoring of rat criteria. Brain slices were obtained by the method of neck end breaking and brain autopsy at the time point of ischemia for 2 h and reperfusion for 24 h. The volumes of infarction in the brain slices were determined by TTC staining.RESULTS(1) In the successful MCAO rats, the average local blood flow remarkably decreased from the baseline value of (224.99±75.00)PU to (67.23±6.90)PU in the ischemic period. The mean difference was 157.76 PU and decreasing amplitude of local blood flow was more than 70% by MCAO. In the reperfusion period, the average local blood flow was rapidly recovered to (216.01±7.30)PU after the embolus was pulled out, which was only slightly lower than that of the baseline level without statistical significance. However, the mean difference of 148.78 PU between the local blood flow of reperfusion and local blood flow of cerebral ischemia for 2 h was found (P<0.01). The average local nervous score was 10.35 at 24 h after cerebral ischemia and reperfusion,higher than that of the baseline (0 point). The infracted evidence with remarkable brain edema in the brain slices was clearly observed with TTC staining. (2) In the unsuccessful MCAO rats, the decrease in local blood flow was less than 50%. The local nervous score was 0 point at 24 h, which was equal to the baseline value. No local infraction and brain edema was observed in the brain slices.CONCLUSIONBesides using the local nervous functional scoring, continuously monitoring of blood flow by LDFinvivois a reliable and useful method to confirm the successful establishment of rat MCAO model.

Models,middle cerebral artery occlusion; Laser-Doppler flow meter

R331

A

1000-4718(2011)03-0620-05

2010-09-12

2010-12-17

國家自然科學基金資助項目(No.30770741)；北京市衛生系統高層次衛生技術人才資助項目(No.2009-03-02)

△通訊作者 孟然Tel:010-63926650; E-mail:victor65@126.com；吉訓明 Tel: 010-83548256; E-mail:jixm70@hotmail.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.041