C反應蛋白對人外周血CD14+單核細胞TLR4信號轉導的影響*

彭 隆， 羅艷婷， 劉金來

(中山大學附屬第三醫院心內科，廣東 廣州 510630)

C反應蛋白對人外周血CD14+單核細胞TLR4信號轉導的影響*

彭 隆， 羅艷婷， 劉金來△

(中山大學附屬第三醫院心內科，廣東 廣州 510630)

目的觀察C反應蛋白(CRP)對CD14+單核細胞Toll樣受體4(TLR4)表達的影響，以探討CRP在急性冠脈綜合征(ACS)致炎機制中的作用。方法不同濃度(5、25、50、100 mg/L)和不同作用時間(6、12、24、48 h)的CRP刺激正常人外周血CD14+單核細胞，或者不同濃度TLR4抑制劑預先干預CD14+單核細胞后，再給予CRP刺激。應用流式細胞儀檢測細胞表面TLR4蛋白的表達，定量PCR方法檢測TLR4 mRNA和髓樣分化蛋白2(MD-2)mRNA表達，ELISA檢測刺激前后細胞上清液腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、金屬蛋白酶9(MMP-9)水平。結果CRP可劑量依賴和時間依賴地增加CD14+單核細胞表達TLR4和MD-2，高濃度TLR4抑制劑可完全阻斷CRP對TLR4、MD-2的影響。TNF-α、IL-6、MMP-9與TLR4、MD-2也呈現相同的變化。結論CRP可激活正常人CD14+單核細胞TLR4信號轉導途徑，并誘導產生TNF-α、IL-6、MMP-9，提示CRP可作為病原相關分子模式(PAMP)，通過TLR4模式受體介導而產生炎癥反應，參與動脈粥樣硬化形成，促進ACS炎癥的發展。

C-反應蛋白質； 受體，Toll樣； 單核細胞； 急性冠脈綜合征

研究表明C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)不但是機體的一種炎癥標志物，同時還參與了炎癥反應。大量證據顯示，CRP參與了動脈粥樣硬化的形成，與急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)關系密切，是心血管事件強有力的預測因子[1]。CRP在粥樣斑塊區聚集，誘導炎癥因子、金屬蛋白酶及組織因子的表達[2, 3]，導致斑塊的不穩定[4]。但目前尚不清楚CRP是怎樣在易損斑塊及斑塊破裂的炎癥機制起作用。Toll樣受體是一類介導天然免疫，識別病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)的信號傳遞受體家族，在免疫防御反應中起著重要的作用。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是機體識別細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的主要信號轉導分子[5]，能激活核轉錄因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)、活化蛋白1(activating protein 1,AP-1)，引起炎癥因子的大量釋放，存在于內皮細胞、單核細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞及心肌細胞中。多項研究證明：TLR4在動脈粥樣硬化斑塊中高表達，參與其炎癥的發生與發展。本文主要探討CRP是否作為一種PAMP通過TLR4模式受體介導炎癥反應，參與動脈粥樣硬化斑塊炎癥的發生發展。

材 料 和 方 法

1材料

CRP購自Calbiochem；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購自Sigma；藻紅蛋白(phycoerythrin，PE) mouse IgG2a K isotype control、PE anti-human Toll-like receptor 4 (CD284)和藻藍蛋白(allophycocyanin,APC) anti-human CD14均購于eBioscience；逆轉錄試劑盒購于Fermentas；熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；胎牛血清來自Hyclone、RPMI-1640培養基購于Gibco；Trizol試劑為Invitrogen產品；淋巴細胞分離液來自GE Healthcare；ELISA試劑盒為R&D產品。

2方法

2.1細胞培養 收集健康志愿者外周靜脈血，用PBS緩沖液1∶1稀釋。用尖頭吸輕鋪于比重1.077淋巴細胞分離液表面，稀釋血與淋巴細胞分離液體積比為1∶1，形成清晰界面。2 000 r/min離心20 min，用吸管輕輕將處于分層液面白膜狀的單個核細胞吸入另一管內，PBS清洗2次。將細胞重懸于RPMI-1640培養基 (含25 mmol/L HEPES、1 nmol/L谷氨酰胺、10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)。臺盼藍拒染實驗發現活細胞>95%。將細胞接種于培養皿24 h后，第2 d用培養基輕輕清洗2次，將未貼壁細胞洗脫，用0.5%的胰酶消化貼壁細胞，以FITC-反義-人-CD14標記，流式細胞術檢測鑒定單核細胞陽性率約80%。調整細胞密度為1×109cells/L，并接種于6孔培養板，每孔1 mL。

2.2細胞分組處理 實驗分為3組進行。CRP量效組：將CRP 5、25、50、100 mg/L，分別與CD14+單核細胞孵育24 h，空白對照不加任何試劑，陽性對照加入LPS 10 mg/L。CRP時效組：將CRP 50 mg/L分別與CD14+單核細胞孵育6、12、24、48 h。TLR4阻斷劑干預組：將PE anti-human TLR4配成5 mg/L、20 mg/L和30 mg/L 3個濃度分別與CD14+單核細胞孵育2 h，再加入CRP 50 mg/L孵育24 h。

2.3流式細胞儀檢測CD14+單核細胞上TLR4蛋白表達 收集不同處理的單核細胞400 μL，PBS緩沖液沖洗2次，加APC anti-human CD14 20μL及PE anti-human Toll-like receptor 4 20 μL，室溫避光孵育15 min，PBS緩沖液沖洗2次后，500 μL PBS緩沖液重懸，移入測定管。陰性對照標本不加以上單克隆抗體，而加入PE mouse IgG2a K isotype control。流式細胞儀收集細胞10 000個，檢測TLR4蛋白表達的陽性率。

2.4RT-PCR測定CD14+單核細胞TLR4 mRNA及髓樣分化蛋白2(myeloid differentiation protein 2,MD-2) mRNA的表達 分別收集每孔細胞，1 500 r/min離心10 min，去上清。每管加入1 mL Trizol，按照 Trizol說明書提取各組細胞的總 RNA后，1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RNA的完整性，微量分光光度計檢測 RNA的純度及含量，而后在 37 ℃、Olig (dt) 作為引物，將 RNA逆轉錄為 cDNA, cDNA逆轉錄按試劑盒說明書進行。PCR引物設計參考文獻，由上海英駿公司合成。TLR4正義序列為5’-AGATGGGGCATATCAGAGC3’，反義序列為5’-CCAGAACCAAACGATGGAC-3’，產物長度500 bp；MD-2正義序列為5’-ATTGGGTCTGCAACTCATCC-3’，反義序列為5’-ATTGGGTCTGCAACTCATCC-3’，產物長度234 bp；內參照β-actin正義序列為5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’，反義序列為5’-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’，產物長度359 bp。

PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共 35個循環，最后72 ℃10 min。產物用2%的瓊脂糖膠進行檢測。用數碼凝膠圖像分析系統作條帶密度掃描，結果以目的條帶與對應的β-actin吸光度值表示。

2.5熒光定量PCR 用上述逆轉錄的cDNA為模板，使用SYBR?Green I嵌合熒光法，按試劑盒進行操作。95 ℃ 30 s 預變性后， 95 ℃ 30 s， 60 ℃ 31 s， 40個循環，最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s溶解。根據2-△△Ct值計算mRNA表達的相對量。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參照，正義鏈為5’-AGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAA-3’，反義鏈為5’-CATATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTG-3’，產物大小91 bp。

2.6ELISA檢測 細胞經分組處理培養后收集上清液，步驟嚴格按照試劑盒操作說明進行，分別檢測細胞上清液中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素 6(interleuki 6,IL-6)、金屬蛋白酶 9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)水平。

3統計學處理

結 果

1CRP誘導人外周血CD14+單核細胞TLR4蛋白的表達

采用流式細胞術檢測CD14+單核細胞經不同濃度、不同時間的CRP刺激后細胞表面TLR4表達變化。CD14+單核細胞在CRP濃度為5、25、50、100 mg/L培養24 h，細胞表面TLR4蛋白表達分別為(32.22±2.80)%、(49.94±5.58)%、(74.82±3.24)%和(90.82±2.88)%。當細胞在5 mg/L CRP培養24 h后，TLR4陽性細胞數開始增加，隨著CRP濃度的增加，TLR4陽性細胞呈現增長趨勢，并在CRP 100 mg/L時，TLR4陽性細胞百分比達到高峰。陽性對照組LPS 10 mg/L組為(98.91±0.74)%，P<0.01，見圖1。當單核細胞在CRP 50 mg/L刺激下，隨著孵育時間的增加， TLR4陽性細胞百分比逐漸增加，24 h時TLR4表達達高峰[(81.71±2.92)%]后，TLR4表達緩慢下降，48 h時TLR4陽性細胞百分比為(50.57±3.34)%，P<0.01，見圖2。

圖1不同劑量CRP對CD14+單核細胞表達TLR4蛋白的影響

圖250mg/LCRP不同時間刺激CD14+單核細胞后TLR4的表達

2CRP對外周血CD14+單核細胞TLR4及MD-2mRNA表達的影響

采用熒光定量PCR技術檢測細胞內TLR4和MD-2 mRNA表達，經過GAPDH標準化后，單核細胞分別在CRP濃度為5、25、50、100 mg/L培養24 h，TLR4 mRNA表達增加達159%、211%、320%和390%，MD-2 mRNA表達增加達146%、236%、311%和416%。單核細胞在CRP 50 mg/L培養6、12、24、48h，TLR4 mRNA表達增加162%、264%、354%和208%，MD-2 mRNA表達增長147%、241%、311%和190%。TLR4及MD-2 mRNA在CRP 50 mg/L孵育24 h時達高峰，之后逐漸降低,P<0.01，見圖3、4。

圖3不同劑量CRP對CD14+單核細胞表達TLR4及MD-2mRNA的影響

圖4不同時間CRP對CD14+單核細胞表達TLR4及MD-2mRNA的影響

3細胞上清液中TNF-α、IL-6、MMP-9的變化

ELISA法測定不同濃度CRP刺激CD14+單核細胞后TNF-α、IL-6和MMP-9的結果見表1。隨著CRP濃度的增加，單核細胞分泌TNF-α、IL-6和MMP-9含量逐漸增加，當CRP 100 mg/L時，TNF-α、IL-6和MMP-9含量均較空白對照組升高，差異顯著(P<0.01)；而作為陽性對照組，單核細胞經LPS 10 mg/L刺激后，TNF-α、IL-6和MMP-9含量分別增加10.1倍、31.5倍和5.1倍，見表1。

觀察50 mg/L CRP通過不同時間刺激CD14+單核細胞發現：IL-6、TNF-α和MMP-9表達量均受CRP孵育時間延長而增加，IL-6于48 h達峰值；而 TNF-α和MMP-9峰值出現在24 h，較空白對照組分別增加8.1倍和2.8倍，然而繼續孵育至48 h時，兩者表達有所下降，見表2。

為了解CRP刺激TNF-α、IL-6和MMP-9表達是否受TLR4信號轉導的影響，采用不同濃度TLR4抑制劑與50 mg/L CRP共孵育CD14+單核細胞。與50 mg/L CRP刺激而未加TLR4抑制劑的單核細胞相比，當TLR4抑制劑濃度為20 mg/L時，單核細胞分泌TNF-α、IL-6和MMP-9開始顯著減少(均P<0.01)；當TLR4抑制劑濃度為30 mg/L時，TNF-α、IL-6和MMP-9含量分別減少88.9%、89.1%和74.4%，見表3。

表1 不同濃度CRP刺激CD14+單核細胞后TNF-α、IL-6和MMP-9的變化

**P<0.01vscontrol.

表250mg/LCRP不同時間刺激CD14+單核細胞后TNF-α、IL-6和MMP-9的變化

CRP50mg/L0h6h12h24h48hTNF-α(ng/L)12.8±2.432.6±3.3**60.5±0.9**98.3±8.3**86.5±2.9**IL-6(ng/L)107.4±30.0172.0±45.4**312.0±32.7**511.3±76.2**511.8±46.5**MMP-9(μg/L)141±12193±12314±14**406±30**360±18**

**P<0.01vs0 h.

表3TLR4抑制劑對50mg/LCRP刺激CD14+單核細胞后TNF-α、IL-6和MMP-9的影響

TLR4inhibitor(mg/L)052030TNF-α(ng/L)96.1±6.080.5±7.933.9±3.2**10.6±2.7**IL-6(ng/L)537.6±26.2433.8±18.2173.8±59.6**58.5±25.0**MMP-9(μg/L)466±45362±28210±23**119±38**

**P<0.01vs0 mg/L TLR4 inhibitor.

討 論

炎癥貫穿動脈粥樣硬化過程的始終。易損斑塊與斑塊破裂、繼發血栓形成是ACS主要的發病機制[6]?；顒有匝装Y為判斷易損斑塊的主要標準之一[4]。各種危險因素引起斑塊局部炎癥，巨噬細胞浸潤、吞噬脂質形成泡沫細胞引起脂質核心的擴大[7]；炎癥因子刺激單核/巨噬細胞分泌大量的MMP-9，降解纖維帽內膠原，導致纖維帽變薄，斑塊極不穩定、容易破裂而引起急性冠脈事件的發生[8]。

TLR是一類介導天然免疫的跨膜信號轉導受體家族，其信號轉導可以通過核因子кB(NF-кB)激活細胞因子基因轉錄，是炎癥信號傳遞的門戶蛋白，在免疫防御反應中起重要作用。近年研究發現，不穩定型心絞痛和急性心肌梗死患者外周血單核細胞TLR4表達及其下游信號的轉導顯著高于正常人和穩定型心絞痛[9]，且在動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞和內皮細胞上TLR4表達增加，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)能上調巨噬細胞TLR4的表達[10]。LPS是TLR4外源性配體[11]，在MD-2協助下與TLR4結合，通過髓樣分化因子88(MyD88)介導下游的信號轉導，激活NF-κB，誘導細胞因子及前炎癥因子如TNF-α、IL-6的產生。MD-2是結合在TLR4胞外區的一種髓樣分化蛋白，它直接與LPS結合而將LPS信號傳至TLR4，可增強單核細胞經TLR4對LPS的反應，實現LPS信號的胞內轉導。王紅艷等[12]研究表明TLR4經LPS激動后，可增加單核細胞及內皮細胞上黏附因子氧化低密度脂蛋白受體(LOX-1)的表達，介導ox- LDL促動脈粥樣硬化作用。以上證據說明TLR4介導的免疫反應在動脈粥樣硬化發生發展中起重要作用。因此，尋找TLR4內源性配體，以及阻斷TLR4介導的信號轉導則顯得尤為重要。

Tanaka等[13]報道高敏C反應蛋白(hs-CRP)水平與斑塊破裂數目呈正相關，提出CRP在斑塊破裂及繼發血栓的形成中起關鍵作用。大劑量的CRP能抑制過氧化物酶體增生物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)[14]，此受體具有抗血管炎癥反應的作用，促進膽固醇逆向轉運，升高循環中的高密度脂蛋白(HDL)水平，反映出CRP在動脈粥樣硬化斑塊形成過程的重要作用。Nomoto等[15]研究發現，hs-CRP水平在ACS組較穩定型心絞痛和對照組顯著增高(分別為44.5 mg/L、2.1 mg/L和0.6 mg/L)。Pasceri等[16]用CRP 10 mg/L處理培養的主動脈內皮細胞24 h后，細胞間黏附分子(ICAM-1)，血管細胞黏附因子(VCAM-1)及E-選擇素表達增加，從而證實在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中，CRP濃度的增加可促進巨噬細胞和T細胞向血管壁遷移。

研究發現CPR能以劑量依賴性增加肺動脈平滑肌上NF-κB 表達，而NF-κB 作為TLR4信號轉導的媒介因子，勢必將會引起TLR4信號通路激活[17]。我們的研究直接證明：CRP可劑量依賴和時間依賴地誘導CD14+單核細胞表達TLR4和MD-2。CRP在濃度為5 mg/L時，即對TLR4表現出一定的促進作用，隨著劑量增加效應增強，100 mg/L時達最大效應。CRP 50 mg/L在作用24 h時達峰值，隨后逐漸下降，我們推測由于CRP的半衰期為19 h，CRP逐漸降解或被受體介導清除，其誘導TLR4表達的作用降低。

TNF-α、IL-6是重要的炎癥細胞因子，與機體的免疫炎癥反應關系密切，均參與動脈粥樣硬化的發生、發展。我們的研究證明：外周血單核細胞在不同濃度CRP蛋白刺激24h后，TNF-α、IL-6在CRP濃度為5 mg/L時便隨之升高，并在CRP達100 mg/L 時分別增加8.37倍和19.9倍。在50 mg/L CRP條件下培養6 h、12 h、24 h和48 h，TNF-α于24 h內均隨著培養時間越長，表達量越高，而在48 h時，表達量降低；而IL-6在48 h達到峰值。應用TLR4特異性阻斷劑后，TNF-α、IL-6表達量則顯著減少，甚至降至基礎水平。由此可見，CRP可以通過上調TLR4的表達，激活TLR4介導的固有免疫，促進炎癥細胞因子基因的表達，促進ACS發生及發展。

CRP還能通過TLR4信號傳導途徑呈劑量和時間依賴性增加MMP-9的釋放，MMP-9在受CRP 25 mg/L刺激時逐漸升高，當CRP濃度增加到50 mg/L以上時，MMP-9增加非常顯著；在50 mg/L CRP濃度下培養6 h、12 h、24 h后，MMP-9均隨著培養時間越長，表達量越高，但培養48 h，MMP-9水平反而呈下降趨勢。Inokubo等[18]、劉金來等[19]均有研究結果證實：ACS患者MMP-9血漿水平較正常對照組顯著升高。MMP-9是動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞分泌的主要基質金屬蛋白酶，可以降解粥樣斑塊內細胞外各型膠原及明膠，是動脈粥樣硬化形成和粥樣斑塊破裂的重要促進因素。

總之，我們的研究證實：CRP能激活正常人單核細胞TLR4信號轉導途徑，并誘導TNF-α、IL-6及MMP-9的產生，提示CRP可作為病原相關分子模式(PAMP)，通過TLR4模式受體介導而產生炎癥反應，在易損斑塊形成和發展過程中起重要作用，從而促進ACS的進展。

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EffectsofC-reactiveproteinonsignaltransductionofToll-likereceptor4inCD14+monocytes

PENG Long, LUO Yan-ting, LIU Jin-lai

(DepartmentofCardiology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lj.lai@medmail.com.cn)

AIM: To observe the influence of C-reactive protein (CRP) on Toll-like receptor 4 (TLR4) expression in CD14+monocytes, and to investigate the role of CRP in the inflammatory mechanism of acute coronary syndrome (ACS).METHODSMonocytes were isolated from peripheral blood of healthy volunteers by Ficoll density gradient centrifugation. The cells were stimulated with CRP at different doses (5, 25, 50, 100 mg/L) and different exposure time (6 h, 12 h, 24 h or 48 h). TLR4 inhibitor at different doses was co-incubated with the cells in the presence of CRP. The protein expression of TLR4 was measured by flow cytometry, and the mRNA expression of TLR4 and MD-2 was determined by quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR). The levels of tumor necrosis factor α(TNF-α), interleukin 6(IL-6) and matrix metalloproteinase 9(MMP-9) in the supernatants of cultured medium were measured by ELISA.RESULTSCRP increased the proteins of TLR4 and MD-2 in CD14+monocytes in dose-dependent and time-dependent manners. TLR4 inhibitor at high dose completely blocked the up-regulation of TLR4 and MD-2 induced by CRP. The same changes were found in the levels of TNF-α, IL-6 and MMP-9.CONCLUSIONCRP activates the signal transduction of TLR4 on CD14+monocytes, and induces the production of TNF-α, IL-6 and MMP-9, indicating that CRP may be as a pathogen associated molecular pattern (PAMP) to induce the inflammatory response via TLR4, and may contribute to the plaque vulnerability in atherosclerosis.

C-reactive protein; Receptors,Toll-like; Monocytes; Acute coronary syndrome

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.011

1000-4718(2011)01-0056-06

2010-08-06

2010-10-21

廣東省自然科學基金資助項目(No.07001556)

△通訊作者 Tel：020-85252168；E-mail：lj.lai@medmail.com.cn