不同轉移潛能肝癌細胞株GRP78的表達及其對肝癌細胞生物學行為的影響*

徐 智, 陽書華, 王 愷, 黃明文, 鄒書兵

(南昌大學第二附屬醫院肝膽外科,江西 南昌 330006)

不同轉移潛能肝癌細胞株GRP78的表達及其對肝癌細胞生物學行為的影響*

徐 智, 陽書華, 王 愷△, 黃明文, 鄒書兵

(南昌大學第二附屬醫院肝膽外科,江西 南昌 330006)

目的研究葡萄糖調節蛋白78(GRP78)在不同轉移潛能肝癌細胞株內的表達及其對肝癌細胞生物學行為的影響。方法應用GRP78反義寡核苷酸(GRP78 ASODN)轉染肝癌細胞株HepG2和MHCC97-H。逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術檢測肝癌細胞內GRP78 mRNA的表達，Transwell小室實驗和細胞黏附實驗分別檢測2種肝癌細胞的侵襲、遷移及黏附能力。結果2種細胞內均有GRP78的表達，MHCC97-H細胞表達較HepG2高(P<0.05)。GRP78 ASODN可以有效地抑制2種肝癌細胞株內GRP78的表達。GRP78 ASODN轉染的高侵襲潛能的MHCC97-H肝癌細胞的侵襲、遷移和黏附能力較對照組有明顯的下降(P<0.05)，而低侵襲潛能的HepG2肝癌細胞侵襲、遷移及黏附能力下降不明顯(P>0.05)。結論抑制肝癌細胞內GRP78的表達可以削弱其侵襲、遷移及黏附能力，GRP78可能成為肝癌治療上有效的分子靶點。

葡萄糖調節蛋白78； HepG2細胞； MHCC97-H細胞； 侵襲; 轉移

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)高死亡率的原因是早期轉移和復發，尤其是HCC根治性切除術后的高復發率嚴重影響肝癌總體療效[1]。有研究報道，葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)參與腫瘤的發生與進展, 并且是腫瘤細胞存活的關鍵因素之一。同時GRP78還參與了腫瘤耐藥性的調節及轉移過程[2]。但GRP78對肝癌細胞的生物學行為是否有影響，目前國內外報道較少。為探討GRP78在不同轉移潛能肝癌細胞內的表達狀態及其對肝癌細胞的侵襲、黏附和運動能力的作用，我們選取低侵襲潛能的人肝癌細胞株HepG2及具有高侵襲潛能的肝癌細胞株MHCC97-H，檢測GRP78的表達狀態，并運用反義寡核苷酸技術特異性地下調上述細胞內的GRP78的表達，研究GRP78對肝癌細胞侵襲、遷移和黏附能力的影響。

材 料 和 方 法

1主要試劑

DMEM高糖培養基購自Gibco，胎牛血清購自Hyclone，MHCC97-H肝癌細胞株購自復旦大學肝癌研究所，HepG2購自中科院上海細胞庫，總RNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒均購自全是金公司， LipofectamineTM2000 購自Invitrogen，噻唑藍MTT購自華美生物工程有限公司， Matrigel購自BD， Transwell小室購自Costar。

2細胞株培養

2種肝癌細胞均接種于含有10%胎牛血清的高糖DMEM(不含抗生素)，并放置在37 ℃、5% CO2孵箱內培養，3-4 d傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

3半定量RT-PCR檢測HepG2及MHCC97-H細胞GRP78mRNA的表達

收集HepG2及MHCC97-H對數生長期細胞并提取總RNA。GRP78上游引物序列 5’-TGGCT-CGACTCGAATTCCAAAG-3’,下游引物序列 5’-GTCAGGCGATTCTGGTCATTGG-3’, 片段大小513 bp。β-actin引物上游 5’- GTTTGAGACCTTCAACACCCC-3’，下游5’-GTGGCCATCTCTCTTGCTCGAAGTC-3’，片段大小308 bp。PCR 條件為: 94 ℃預變性5 min, 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 50 s, 72 ℃ 1 min, 循環35次, 末次72 ℃ 10 min。PCR產物經1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分離, 溴乙啶染色, 凝膠成像儀掃描, 以 GRP78/β-actin吸光度比值作為GRP78 mRNA的相對表達水平。

4脂質體介導寡核苷酸轉染及轉染后GRP78mRNA的檢測

GRP78 mRNA反義寡核苷酸(GRP78 antisense oligonucleotide,GRP78 ASODN)序列如下[3]：5’-GGGAGAGCTTCATCTTGCCAGCC-3’，對照組(random oligonucleotide,RODN)序列：5’-AAAAGGGGGGG-CCCCCCCTTTTT-3’，均采取全程硫代修飾， 5’端以綠色熒光蛋白標記。根據RT-PCR檢測GRP78 mRNA的降低水平，篩選出使GRP78 mRNA降低最明顯的濃度為GRP78 ASODN的最適濃度，MHCC97-H和HepG2最佳轉染濃度分別為200 nmol/L和350 nmol/L。本實驗分為4組:A組空白組(培養液),B組對照組(培養液+脂質體),C組陰性對照組(培養液+脂質體+RODN),D組實驗組(培養液+脂質體+GRP78 ASODN)。轉染前1 d分別種板，2種細胞的密度相同(圖5)。按照LipofectamineTM2000說明轉染HepG2和MHCC97-H細胞。2種肝癌細胞的轉染效率分別為83.56%±3.84%和88.37%±2.63%。根據實驗分組分別收集轉染48 h后的細胞，按照前述方法檢測轉染后2種細胞內GRP78 mRNA的表達狀態。

5檢測細胞侵襲和運動能力

采用Transwell小室，取20 μL Matrigel鋪至Transwell小室上室。取轉染后培養48 h的HepG2、MHCC97-H肝癌細胞，制成 2×108cells/L單細胞懸液，取200 μL移入上室內；下室內加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養液，37 ℃培養24 h后取出。以棉簽小心刮除濾膜上室面的細胞，侵襲到下室面的細胞以甲醛固定，HE染色，在×400光鏡下任取 5個視野計算細胞數，以其均數表示侵襲細胞數。細胞運動能力的檢測，實驗方法與檢測細胞侵襲力的方法相同,只是不在聚碳酸酯濾膜上鋪20 μL Matrigel膠, 37 ℃培養12 h后取出。

6細胞黏附能力的檢測[4]

取轉染后培養48 h的HepG2、MHCC97-H肝癌細胞，96孔培養板覆以matrigel膠 50 μg/孔,膠干后,加入預處理的5×108cells/L 單細胞懸液50 μL,37 ℃搖床100 r/min,作用60 min,每孔加無血清DMEM 150 μL及MTT(5 g/L)50 μL,37 ℃繼續作用4 h，棄上清, 每孔加入150 μL DMSO原液，每組設6個復孔, 10 min后上酶標儀, 在490 nm單波長下測定A值。

7統計學處理

結 果

1GRP78mRNA的表達

RT-PCR結果顯示GRP78mRNA在正常的HepG2及MHCC97-H細胞內均有表達，但2種細胞內的GRP78mRNA的表達存在差異，GRP78在MHCC97-H表達較HepG2高(P<0.05)，見圖1、表1。

Figure 1. The expression of GRP78 mRNA in different hepatocellular carcinoma cell lines.A： the expression of GRP78 mRNA in nomal MHCC97-H and HepG2 cells;B：the expression of GRP78 mRNA in different groups. Lane 1: MHCC97-H-control； Lane 2: MHCC97-H-RODN；Lane 3: MHCC 97-H-GRP78 ASODN；Lane 4:HepG2-GRP78 ASODN；Lane 5: HepG2-RODN；Lane 6: HepG2-control.

圖12種肝癌細胞內各組GRP78mRNA的表達變化

表1 2種肝癌細胞GRP78 mRNA表達量

A：normal cells；B：lipo2000；C：400 nmol/L RODN+lipo2000；D：GRP78 ASODN+lipo2000.△P<0.05vsgroup B;*P<0.05vsHepG2 in group A.

2GRP78ASODN對2種細胞株內GRP78mRNA表達的影響

2種細胞株轉染GRP78 ASODN后在熒光顯微鏡下呈綠色，見圖5。RT-PCR結果顯示，空白組、對照組和陰性對照組三者間GRP78 mRNA的表達無顯著差異(P>0.05)。但實驗組GRP78 ASODN轉染后的細胞其GRP78 mRNA表達下降明顯，與其它3組比較均有明顯差異(P<0.05),見圖1、表1。以上結果表明GRP78 ASODN能夠有效抑制該2種肝癌細胞株內的GRP78 mRNA的基因表達。

3沉默2種細胞株內GRP78mRNA表達對侵襲、遷移的影響

通過Transwell小室法檢測，沉默了2種肝癌細胞株內GRP78 mRNA的表達后，細胞的侵襲、遷移能力不同。MHCC97-H細胞株轉染GRP78 ASODN后細胞的侵襲和運動遷移能力均有明顯降低，與其余3組比較均有明顯差異(P<0.05)。MHCC97-H細胞空白組、對照組及陰性對照組的細胞侵襲和運動遷移能力下降不明顯(P>0.05)，見圖2。而轉染了GRP78 ASODN的HepG2細胞其侵襲和運動遷移能力下降的并不明顯，與各組比較無明顯差異(P>0.05)，見圖3。

Figure 2. The invasive and migratory number of MHCC97-H cells in each group.A:normal cells;B:lipo2000;C:400 nmol/L RODN+lipo2000;D:200 nmol/L GRP78 ASODN+lipo2000.*P<0.05vsgroup B.

圖2MHCC97-H細胞侵襲和遷移的數量

Figure 3. The invasive and migratory number of HepG2 cells in each group.A:normal cells;B:lipo2000;C:400 nmol/L RODN+lipo2000;D:350 nmol/L GRP78 ASODN+lipo2000.

圖3HepG2細胞侵襲和遷移的數量

4細胞黏附能力的檢測

2種細胞沉默了細胞株內GRP78 mRNA的表達后，細胞的黏附能力有所不同。MHCC97-H細胞株的實驗組轉染了GRP78 ASODN后，細胞的黏附能力下降明顯，與其它3組比較存在明顯差異(P<0.05)。HepG2細胞株的實驗組轉染GRP78 ASODN后，細胞黏附能力有所下降，與其余3組細胞比較無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. Adhesion of HCC cells in different groups.A:normal cells;B:lipo2000;C:400 nmol/L RODN+lipo2000;D:GRP78 ASODN+lipo2000.*P<0.05vsgroup B.

圖42種肝癌細胞黏附力檢測

討 論

肝細胞肝癌的病死率較高，其總體效果不佳，原因主要為肝細胞肝癌的早期轉移和復發。目前認為肝癌術后復發的重要原因是手術切除原發腫瘤后肝內轉移病灶繼續生長為臨床可發現的腫瘤[5]。抑制肝癌轉移成為肝癌治療研究的一個重點。

GRP78是細胞內質網內分泌的一種蛋白，被認為是熱休克蛋白70(HSP70)家族成員之一。研究發現GRP78除了駐留在內質網腔中起到分子伴侶的作用外, 還可以轉運至細胞膜、細胞漿, 甚至分泌到細胞外, 參與細胞分化、細胞生存、血管形成等重要生物學過程的調控, 是一種多功能蛋白質[6]。同時它還能夠增強細胞應對外界刺激的能力，從而延長細胞在各種不利因素刺激下的生存期[7]。GRP78廣泛表達于乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞內[8]。GRP78不僅在腫瘤細胞內，在轉移的淋巴結組織當中也是高表達的，抑制GRP78表達可以降低腫瘤細胞的侵襲轉移能力[9,10]。這為研究抑制腫瘤轉移提供了一個新的途徑。

Figure 5. Morphological observation of MHCC97-H and HepG2 transfected with GRP78 ASODN;A: morphological observation of MHCC97-H cells transfeted with GRP78 ASODN;B: morphological observation of HepG2 cells transfeted with GRP78 ASODN.

圖5MHCC97-H與HepG2轉染GRP78ASODN后細胞形態觀察

本組2種肝癌細胞株的RT-PCR結果表明，GRP78在這2種肝癌細胞內均有表達，但MHCC97-H肝癌細胞內GRP78的表達較HepG2肝癌細胞高，兩者差異顯著(P<0.05)。在Shuda等[11]和Luk等[12]的研究中，他們發現GRP78在肝癌內是高表達的，并在其發展過程中起重要作用，認為這主要是打破了細胞增殖與凋亡間平衡的結果，促進了肝癌的產生和進展。

肝癌細胞的侵襲轉移是個復雜的多步驟過程。肝臟是個富血供的器官，腫瘤對血管的高侵襲性也是肝癌容易轉移、復發的重要原因之一。本組實驗采用的HepG2肝癌細胞是一種低侵襲潛能的肝癌細胞株，MHCC97-H是一種具有高侵襲潛能的肝癌細胞株[13]。本實驗結果表明，抑制了這2種具有不同轉移潛能肝癌細胞內GRP78 mRNA的表達后，2種細胞的侵襲、運動及黏附能力均有降低，但高轉移潛能的MHCC97-H肝癌細胞的侵襲、運動及黏附能力降低更明顯。而低轉移潛能的HepG2肝癌細胞的侵襲、運動及黏附能力降低不明顯。這種抑制作用可能與肝癌細胞本身的侵襲轉移潛能有關。在對乳腺癌細胞的研究中發現，不同轉移潛能的乳腺癌細胞內GRP78的表達是不同的，高轉移潛能的乳腺癌細胞GRP78的表達更高，定位更廣[14]，與本實驗的結果相似。這說明腫瘤細胞內不僅表達GRP78而且其表達量與腫瘤細胞的生物學行為有密切關系。在對肝癌組織的研究中發現，肝癌組織內GRP78是明顯地高表達，且GRP78的表達與肝癌細胞對血管的侵襲和肝內的轉移明顯相關，抑制GRP78的表達可以減少肝癌細胞對血管的侵襲和肝內的轉移[12，15]。

細胞在刺激早期可在轉錄及蛋白水平誘導GRP78表達，并快速達到高峰，說明刺激可誘導內質網發生未折疊蛋白反應以抵抗應激保護細胞，顯示出GRP78快速高效的應激反應能力[16]。腫瘤細胞周圍常伴有低糖、低氧及酸中毒等的微環境，這些不利于腫瘤細胞生長的因素持續存在，刺激了腫瘤細胞大量表達GRP78，是目前認為腫瘤細胞內高表達GRP78的重要原因。腫瘤細胞內持續高表達的GRP78不僅能夠促進腫瘤細胞的存活、增殖，而且促進了腫瘤細胞產生耐藥性，這些共同作用使得腫瘤細胞向著更惡性的方向發展，同時也促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[8]。因此抑制GRP78在腫瘤細胞內的表達有助于抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，減少復發的幾率，這對于提高腫瘤的治療效果，尤其是防止肝癌術后復發轉移提供了一個方向。

GRP78可在不同轉移潛能的肝癌細胞內的表達，其表達量的不同可能與肝癌細胞的生物學行為有關。GRP78對不同轉移潛能肝癌細胞的侵襲轉移能力作用是不同的。本研究結果表明抑制GRP78的表達能夠降低肝癌細胞的侵襲、運動和黏附能力。這為利用GRP78作為肝癌治療的一個分子靶點提供了理論依據。然而GRP78調節肝癌細胞侵襲轉移的具體機制尚需進一步研究。

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EffectofGRP78expressiononbiologicalbehaviorsofhepatocellularcarcinomacellswithdifferentmetastaticpotentials

XU Zhi, YANG Shu-hua, WANG Kai, HUANG Ming-wen, ZOU Shu-bing

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:neswk@163.com)

AIM: To explore the effect of glucose-regulated protein 78(GRP78)expression on the biological behaviors of hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potentials.METHODSThe GRP78 antisense oligonucleotide (GRP78 ASODN) was transfected into hepatocellular carcinoma cell lines, HepG2 and MHCC97-H. The mRNA expression of GRP78 in the two cell lines was assessed by RT-PCR. Transwell chamber assay was used to detect the cell invasion and migration. Cell adhesion assay was employed to investigate the cell adhesion.RESULTSThe positive GRP78 expression was observed in both HepG2 and MHCC97-H cells. The expression level of GRP78 in MHCC97-H cells was higher than that in HepG2 cells. GRP78 expression was effectively depressed by the transfection of GRP78 ASODN in both cell lines. The invasive, migratory and adhesive potentials of MHCC97-H cells after GRP78 ASODN transfection were more significantly depressed than those of HepG2 cells (P<0.05). GRP78 ASODN transfection did not affect the biological behaviors of HepG2 cells.CONCLUSIONInhibition of GRP78 expression in hepatocellular carcinoma cell lines depresses the cell invasion, migration and adhesion, indicating that GRP78 is a prospective molecular therapy target in hepatocellular carcinoma.

Glucose-regulated protein 78; HepG2 cells; MHCC97-H cells; Invasiveness; Metastasis

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.021

1000-4718(2011)01-0108-05

2010-07-21

2010-11-19

江西省教育廳基金資助項目(No. GJJ09092)

△通訊作者 Tel:0791-6300249;E-mail: neswk@163.com