5-氟尿嘧啶改變胰島β細胞的超微結構并抑制胰島素的釋放*

馮覺平， 林 梅， 袁響林， 王亞萍， 方 靜， 李 敏

(1華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院腫瘤科，湖北 武漢430034；2華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院腫瘤中心，湖北 武漢 430030)

5-氟尿嘧啶改變胰島β細胞的超微結構并抑制胰島素的釋放*

馮覺平1△， 林 梅1， 袁響林2， 王亞萍1， 方 靜1， 李 敏1

(1華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院腫瘤科，湖北 武漢430034；2華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院腫瘤中心，湖北 武漢 430030)

目的探討5-氟尿嘧啶(5-FU)抑制小鼠胰島β細胞(NIT-1細胞)胰島素分泌的相關分子機制。方法不同劑量的5-FU作用于NIT-1細胞，放射免疫分析法檢測細胞胰島素分泌功能的變化；Annexin V/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡；透射電鏡觀察細胞超微結構的變化；RT-PCR及Western blotting 檢測胰十二指腸同源盒蛋白-1(PDX-1)mRNA和蛋白的表達。結果5.0-40.0 mg/L的5-FU作用24 h后，低濃度葡萄糖(5.6 mmol/L)環境下，NIT-1細胞胰島素分泌無明顯下降(P>0.05)；而高濃度葡萄糖(16.7 mmol/L)刺激下的胰島素分泌量可被5.0-40.0 mg/L 5-FU以劑量依賴性的方式所抑制(P<0.01)。細胞凋亡率明顯增高(P<0.05)；透射電鏡可見線粒體結構改變；經10.0-40.0 mg/L的5-FU作用24 h后，PDX-1 mRNA及蛋白表達的水平均有不同程度的下降(P<0.05)。結論5-FU可通過誘導細胞凋亡、導致β細胞超微結構改變及數量減少而抑制胰島β細胞高糖刺激下的胰島素釋放。下調PDX-1基因表達可能是5-FU在高糖條件下誘導β細胞凋亡的機制之一。

氟尿嘧啶； NIT-1細胞； 胰島素分泌； 超微結構； 胰腺十二指腸同源盒蛋白質1

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)一直是結直腸癌化療最主要、最基礎的藥物,是目前研究的熱點[1，2]。其常見的毒副作用如：骨髓抑制、肝腎功能的損害等已被學者廣泛關注。然而近年來新的研究顯示，含5-FU的聯合化療可使結直腸癌患者血糖水平增高[3,4]，嚴重者可因酮癥酸中毒昏迷而死亡[3]。由于5-FU所誘發的糖尿病(diabetes mellitus, DM)的機制尚不清楚，因此使得有針對性的預防和治療較為困難。多項非腫瘤性DM基礎研究顯示：其β細胞功能受損與β細胞數量減少有關[5]，而胰十二指腸同源盒蛋白-1 (pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)是胰島素基因最重要的轉錄激活因子[6]，它參與了一系列與維持β細胞特性和功能有關基因的轉錄調控。本研究以NIT-1細胞株為研究對象，以探討結腸癌常用化療藥物5-FU對NIT-1細胞胰島素分泌、凋亡及超微結構的影響及其與PDX-1基因表達的關系。

材 料 和 方 法

1試劑

5-FU購自天津金耀氨基酸有限公司，四甲基偶氮唑鹽購自Sigma；胎牛血清、DMEM培養粉、瓊脂糖購自Gibco；胰島素放射免疫試劑盒購自天津九鼎醫學生物有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC &PI ) 購自晶美生物；TRIzol Reagent購自Invitrogen;M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑購自Promega。引物由上海生工生物公司合成。

2方法

2.1細胞培養 小鼠胰島細胞株NIT-1由華中醫科大學同濟醫院內分泌科實驗室惠贈。NIT-1細胞用含10%胎牛血清的F12培養液，在37 ℃、5% CO2濃度的孵育箱中傳代培養，細胞貼壁生長，0.25%胰蛋白酶常規消化，每5-6 d傳代1次，按所需濃度接種。

2.2放射免疫分析法檢測NIT-1細胞的胰島素分泌 細胞以1×105cells/well的濃度接種于96孔板，每孔1 mL的細胞懸液。置于培養箱內孵育24 h后，吸棄培養液，加入新的培養液。實驗組為5-FU(5.0-40.0 mg/L)。對照組為等體積F12培養液。孵育24 h后，PBS洗滌2次后，一組換用等體積的含低糖(葡萄糖濃度5.6 mmol/L)的平衡鹽溶液(KRBB)，常規培養1 h，另一組換用等體積的含高糖(葡萄糖濃度16.7 mmol/L)的KRBB緩沖液培養1 h，分別收集培養液于EP管中，凍存于-80 ℃冰箱內待測胰島素含量。上清液內胰島素含量測定采用放射免疫分析法。重復3次。

2.3光鏡觀察 收集上述各組不同培養條件的細胞懸液，于光鏡下觀察細胞形態、拍照。

2.4Annexin V/PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡 分別以不同濃度的5-FU(5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L)為實驗組，以等體積F12培養液為對照組，常規培養24 h。按照annexin V/PI雙染試劑盒說明操作、測定，重復3次。

2.5透射電鏡觀察NIT-1細胞超微結構變化 取對數生長期細胞(5×105cells/well)接種于6孔板，細胞貼壁后加入5-FU(5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L)，對照組加等體積F12培養液，培養24 h。0.25%的胰酶消化，PBS漂洗2次，收集各組細胞以4%多聚甲醛固定。常規包埋、切片、染色(醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色)，透射電鏡觀察細胞超微結構并攝片。

2.6RT-PCR方法檢測PDX-1 mRNA表達 分別收集不同濃度的5-FU(10.0、20.0、40.0 mg/L)作用后的NIT-1細胞分別提取總RNA，行RT-PCR 反應。參照文獻[7]設計引物，PDX-1上游引物5’-TGTAGGCAGTACGGGTCCTC-3’，下游引物5’-CCACCCCAGTTTACAAGCTC-3’，擴增325 bp。內參照β-actin上游引物5’-ATGGATGACGATATCGCT-3’，下游引物5’-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’,擴增569 bp。產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統分析電泳條帶灰度值。PDX-1 mRNA 表達相對強度=PDX-1條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2.7Western blotting檢測PDX-1蛋白的表達 分別收集不同濃度的5-FU(10.0、20.0、40.0 mg/L)作用后的NIT-1細胞，以Bradford法蛋白定量。常規蛋白變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白電泳、轉膜。PVDF膜先后置于1∶500稀釋的Ⅰ抗稀釋液中37 ℃孵育1 h、1∶1 000稀釋的Ⅱ抗稀釋液中孵育，PBS-T洗膜后加入ECL發光液顯色曝光，得到的蛋白條帶利用灰度法檢測其相對蛋白含量，蛋白含量=PDX-1蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

3統計學處理

結 果

15-FU對NIT-1細胞胰島素分泌的影響

如表1所示，在無5-FU作用的情況下，高葡萄糖刺激下(16.7 mmol/L)較基礎葡萄糖(5.6 mmol/L)刺激后的胰島素分泌量明顯增高(P<0.01)；在基礎葡萄糖(5.6 mmol/L)環境下，5-FU (5.0-40.0 mg/L)作用24 h后，隨著5-FU濃度增高，胰島素分泌量稍有下降，但差異無顯著(P>0.05)；在高濃度葡萄糖刺激下，在5.0-20.0 mg/L范圍內，隨著5-FU濃度的增高胰島素分泌量明顯下降，呈劑量依賴性(P<0.01)，與對照組比較，5.0、10.0、20.0和40.0 mg/L 5-FU作用24 h后，胰島素分泌抑制率分別為9.2%、30.4%、50.7%和54.0%。

表1不同濃度5-FU作用下胰島素釋放量測定

5-FU(mg/L)Insulinsecretion(mIU/L)5.6mmol/Lglucose16.7mmol/LglucoseControl13.81±0.5526.05±1.38**5.013.03±1.0623.66±1.36△△10.013.11±0.8518.12±1.20△△20.012.33±0.9512.83±0.88△△40.012.59±0.8211.97±0.62▲▲

**P<0.01vs5.6 mmol/L glucose control group;△△P<0.01vscontrol group and each group in sequence;▲▲P<0.01vscontrol group 5.0 and 10.0 groups.

2光鏡觀察結果

對照組細胞貼壁生長，細胞輪廓清楚。5.0-20.0 mg/L 5-FU作用24 h后，細胞回縮變圓、體積縮小、折光性減弱，5-FU為40 mg/L時細胞脫落增多,見圖1。

Figure 1. The NIT-1 cellular morphology treated with 5-FU under light microscope (×40). A:control; B:20 mg/L 5-FU; C:40 mg/L 5-FU(24 h).

圖1NIT-1細胞光鏡圖

35-FU對NIT-1細胞凋亡的影響

5.0-40.0 mg/L 5-FU組早期凋亡率均明顯高于對照組(P<0.05)；40.0 mg/L 5-FU組晚期凋亡明顯高于對照組及5.0-20.0 mg/L 5-FU組，差異顯著(P<0.01),見表2、圖2。

表2 5-FU對NIT-1細胞凋亡的影響

*P<0.05vscontrol group.

4透射電鏡觀察

對照組β細胞呈圓形，胞膜完整，粗面內質網及高爾基復合體發達，胞質內分泌顆粒豐富。5-FU組呈不同程度的凋亡征象：細胞線粒體腫脹，內質網擴張；胰島素分泌顆粒減少；細胞質內結構密度增大；少數細胞可見核固縮，染色質邊集，胞漿濃縮，內質網疏松并與胞膜融合形成空泡,見圖3。

55-FU對NIT-1細胞PDX-1mRNA及蛋白表達的影響

對照組PDX-1 mRNA及蛋白灰度比分別為1.456±0.133及0.847±0.092。經10.0、20.0、40.0 mg/L 5-FU處理24 h后，PDX-1 mRNA灰度比分別為1.299±0.143、1.119±0.118及0.585± 0.052；PDX-1 蛋白灰度比分別為0.705±0.064、0.513±0.057和0.509±0.062，5-FU處理后mRNA及蛋白表達水平均明顯低于對照組(P<0.05),見圖4。

Figure 2. Apoptosis analysis using annexin V/PI flow cytometry in NIT-1 cells treated with 5-FU.A: control; B: 10.0 mg/L 5-FU; C: 40.0 mg/L 5-FU.

圖25-FU誘導NIT-1細胞凋亡

Figure 3. The NIT-1 cellular morphology treated with 5-FU under transmission electron microscope. A: control; B: endocytoplasmic reticulum swell of mitochondria; C: chromatic agglutination adjacent to the nuclear membrane.

圖3NIT-1細胞透射電鏡圖

圖4NIT-1細胞PDX-1mRNA及蛋白的表達

討 論

繼Tayek等[4]發現在含5-FU方案化療期間非DM結腸癌患者中部分空腹血糖水平增高后，K?hne 等[3]也報道，在含5-FU的聯合方案治療轉移性結直腸癌的患者中，部分非DM患者血糖水平增高，同時2例胰島素依賴型糖尿病患者胰島素需要量增加33%，1例以飲食控制的DM患者死于酮癥酸中毒昏迷。此外，結直腸癌患者化療中，既往有DM的患者較非DM患者的5-FU重度毒性明顯增加[8]。我們也在臨床研究中觀察到，非DM結直腸癌患者在以5-FU為基礎的化療期間可繼發DM[9]。然而截至目前為止，對于5-FU相關的DM的機制我們所知甚少。

本研究中我們用作觀察胰島β細胞功能的NIT-1細胞株來源于NOD小鼠，由SV40和大鼠胰島素基因的啟動子經轉基因方式產生，主要分泌胰島素，對葡萄糖刺激的反應與體外培養的胰島β細胞相似[10]。我們的研究顯示，在無5-FU作用的情況下，高葡萄糖刺激下較基礎葡萄糖刺激后的胰島素分泌量增加1倍左右(P<0.01)，提示高糖可刺激胰島β細胞胰島素的分泌。而這種在高糖刺激下的胰島素分泌又可被5-FU呈濃度依賴的方式部分抑制(P<0.01)，5.0、10.0、20.0和40.0 mg/L濃度時5-FU對胰島素分泌量的抑制率分別為9.2%、30.4%、50.7%和54.0%。但其對胰島素基礎分泌量下胰島素分泌量卻并無明顯影響(P>0.05)。由此我們認為，臨床上5-FU治療后的葡萄糖耐受不良可能與其引起的胰島素相對分泌不足有關。

目前已經明了，糖尿病的β細胞功能受損與β細胞數量減少有關[4]。我們通過光鏡實驗觀察到隨著5-FU濃度的增加及作用時間的延長，死亡細胞明顯增多。證實了5-FU對β細胞的直接毒性可導致β細胞數量的減少。同時我們還觀察到在5-FU作用下β細胞凋亡也明顯增加，并有細胞超微結構的改變，如線粒體腫脹、內質網擴張及染色質邊集等。這些典型的細胞凋亡改變及流式細胞儀檢查的結果均提示：5-FU可誘導β細胞凋亡。因此我們認為5-FU對β細胞的直接毒性和凋亡可能導致了胰島素分泌相對不足，這可能是β細胞功能受損的主要原因。

關于5-FU能夠在高糖條件下誘導β細胞凋亡的機制仍不清楚。目前的研究顯示，β細胞的發育和功能維持受到多種轉錄因子的調控，其中PDX-1是胰島素基因最重要的轉錄激活因子，同時也是葡萄糖激酶、葡萄糖轉運蛋白-2等與胰島素釋放有關的一組基因的轉錄調控因子，在β細胞的發生、分化、成熟及再生等過程中起重要作用[11]。本研究中，在不同濃度的5-FU作用下，PDX-1 mRNA及蛋白表達均明顯減少(P<0.05)。因此我們推測，由于PDX-1基因表達發生變化，β細胞正常功能和完整性也隨之變化，由5-FU所引發的PDX-1基因表達下調可能導致了β細胞凋亡，因此PDX-1基因表達的減少與β細胞功能降低具有密切的關系[12]。

此外，線粒體信號轉導通路在誘導細胞凋亡中可能也起著一定作用。由于線粒體是細胞能量代謝的調控中心，因此線粒體功能異常可減少胰島素分泌且最終導致胰島β細胞凋亡[13]。我們在電鏡中觀察到β細胞線粒體腫脹、內質網擴張等超微結構的變化。因此我們推測：5-FU可能引起線粒體膜通透性轉運孔道開放，使線粒體基質腫脹、線粒體外膜破裂，釋放出促凋亡蛋白，引起caspase級聯反應，從而誘導細胞凋亡[14]。對此我們將進一步深入研究。

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Inhibitoryeffectof5-fluorouracilonultra-microstructureandinsulinsecretionofpancreaticβcells

FENG Jue-ping1, LIN Mei1, YUAN Xiang-lin2, WANG Ya-ping1, FANG Jing1, LI Min1

(1DepartmentofOncology,PuaiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430034,China;2CenterofOncology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:fengjueping@163.com)

AIM: To investigate the molecular mechanisms of β cell dysfunction induced by 5-fluorouracil (5-FU) in islet β cell line (NIT-1 cells).METHODSThe NIT-1 cells were treated with different concentrations of 5-FU. The content of insulin in the culture medium was determined by radioimmunoassay. Cell apoptosis was observed by flow cytometry with annexin V/PI staining. The ultra-microstructural changes of NIT-1 cells were observed under transmission electron microscope. The expression of pancreatic and duodenal homeobox protein 1(PDX-1) at mRNA and protein levels in NIT-1 cells was examined by RT-PCR and Western blotting, respectively.RESULTSExposed to the low glucose concentration (5.6 mmol/L), insulin secretion in NIT-1 cells was not significantly decreased following a 24 h treatment with 5.0 to 40.0 mg/L 5-FU (P>0.05). On the contrary, the high glucose (16.7 mmol/L)-stimulated insulin secretion in NIT-1 cells was inhibited by 5.0 to 40.0 mg/L of 5-FU in a dose-dependent manner after 24 h of incubation (P<0.01). The apoptosis rate of NIT-1 cells was significantly increased as compared to those in the control levels(P<0.05). The structural changes of mitochondria were the main apoptotic changes under transmission electron microscope. Significant down-regulation of PDX-1 expression at mRNA and protein levels was observed in NIT-1 cells treated with 5-FU at the concentration of 10.0 mg/L to 40.0 mg/L(P<0.05).CONCLUSION5-FU inhibits the insulin secretion in islet β cell induced by high glucose. A relative deficiency in insulin secretion following 5-FU treatment is related to the changes of β cell ultra-microstructure and the reduction of β cell numbers, by which an increase in apoptosis of pancreatic β cells is induced. Down-regulation of PDX-1 expression may play a pivotal role in increasing the apoptosis of pancreatic β cells induced by 5-FU in high-glucose condition.

Fluorouracil; NIT-1 cells; Insulin secretion; Ultra-microstructure; Pancreatic and duodenal homeobox protein 1

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.023

1000-4718(2011)01-0119-05

2010-07-20

2010-10-21

湖北省衛生廳重點資助項目( No.2006JX3A26)；武漢市衛生局重點資助項目 (No.武衛05-294)

△ 通訊作者 Tel: 027-68831656；E-mail：fengjueping@163.com