氧誘導視網膜新生血管模型中基質細胞衍生因子1的表達及機制研究*

袁 非， 陳向武

(復旦大學附屬中山醫院眼科， 上海 200032)

氧誘導視網膜新生血管模型中基質細胞衍生因子1的表達及機制研究*

袁 非△， 陳向武

(復旦大學附屬中山醫院眼科， 上海 200032)

目的觀察基質細胞衍生因子1(SDF-1)在氧誘導視網膜新生血管(OIR)模型中的表達情況，并初步研究其在OIR模型中的促新生血管生長機制。方法30只C57BL/6J新生小鼠隨機分為2組。其中15只小鼠置于氧濃度為75%的容器內飼養5 d，再轉移至正常空氣下飼養5 d，作為高氧誘導組；另15只小鼠一直在正常空氣中飼養，作為正常對照組。免疫組織化學方法檢測視網膜SDF-1、CD14蛋白的定位及含量，real-time PCR法檢測視網膜SDF-1 mRNA的表達。結果與正常對照組相比，高氧誘導組突破視網膜內界膜的內皮細胞核數目明顯增多(P<0.01)，血管分支減少，大血管擴張、迂曲。兩組小鼠視網膜神經上皮均可見SDF-1和CD14陽性染色，但高氧誘導組的SDF-1和CD14含量明顯高于正常對照組(均P<0.01)。并且視網膜SDF-1與CD14的蛋白含量存在正相關(r=0.898，P<0.01)。視網膜SDF-1 mRNA表達在高氧誘導組也明顯高于正常對照組(P<0.01)。結論OIR模型小鼠視網膜SDF-1表達增高，其促新生血管功能可能與CD14+細胞有關。

模型,氧誘導視網膜新生血管； 基質細胞衍生因子1； CD14

視網膜新生血管是多種疾病如早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity, ROP)、增殖性糖尿病視網膜病變(proliferating diabetic retinopathy, PDR)等發生的共同病理改變，其造成的滲出、出血和增生等一系列變化最終會導致視力喪失。基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)是一類具有趨化活性的細胞因子[1]，在新生血管的生成過程中起重要作用[2-4]，但具體機制尚未明了。大量資料顯示循環中的CD14+細胞(主要包括內皮祖細胞[5-7]和單核/巨噬細胞)能促進新生血管的生長[8-11]。由于SDF-1是CD14+細胞的高效趨化因子[12, 13]，因此我們推測SDF-1的促新生血管能力是通過趨化循環中CD14+細胞到達缺血部位而發揮作用。本研究旨在了解氧誘導視網膜新生血管模型(oxygen-induced retinopathy，OIR)中SDF-1的表達情況，并通過視網膜SDF-1表達與CD14含量的相關研究來初步探討我們的推測。

材 料 和 方 法

1實驗分組

由中國科學院上海實驗動物中心提供[許可證號為SCXK(滬)2007-0005]7 d C57BL/6J清潔級新生小鼠共30只，隨機將其分為2組：正常對照組(n=15)和高氧誘導組(n=15)。其中正常對照組小鼠于正常環境中飼養10 d至17 d。而高氧誘導組小鼠首先生活在密閉玻璃容器內(容器內氧濃度保持在75%±2%，氣體流量為1.5 L/min)5 d后，轉移到正常環境繼續生活5 d至17 d。

2設備和試劑

2.1儀器設備 氧氣分析儀(CY-12C)購自浙江省建德市梅城電化分析儀器廠。顯微鏡(Leica DM1RB)、高速冷凍離心機(Beckman GS-15R Centrifuge 和Eppendorf Centrifuge 5417R)、紫外線分光光度計 (UV-1601 Shimadau)、熒光定量PCR儀(ABI 7500型)由復旦大學附屬中山醫院中心實驗室提供。

2.2試劑 ADP酶、4%多聚甲醛、Tris-馬來酸緩沖液(0.05 mol/L和0.2 mol/L，pH 7.2)、硝酸鉛、氯化鎂、硫化銨，均由復旦大學上海醫學院組胚實驗室提供。氧氣(純度≥99.99%)與氮氣(純度≥99.8%)，由復旦大學附屬中山醫院提供。堿石灰、75%乙醇、異丙醇、無水乙醇、氯仿，購自上海五四化學試劑有限公司。Trizol試劑購自Invitrogen。引物由上海生工合成。兔抗鼠SDF-1及兔抗鼠CD14 Ⅰ抗、羊抗兔Ⅱ抗、DAB均購自武漢博士德生物工程有限公司。

3視網膜鋪片的制作及二磷酸腺苷酶(adenosinediphosphatase,ADP)酶染色

每組17 d齡小鼠各取3只(6眼)，行乙醚吸入麻醉，解剖小鼠胸腔，充分暴露心臟，將灌注針頭刺入左心室的同時用顯微剪刀剪開右心房，先用生理鹽水灌注約5分鐘，然后灌注4%多聚甲醛溶液約5 min。再摘除小鼠眼球固定于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃過夜。之后在小鼠眼球的角膜緣后約1 mm沿角膜緣環行剪開，去除角膜，取出晶狀體，以視乳頭為中心作4-5個放射狀切開，盡可能清除鞏膜、脈絡膜和視網膜色素上皮層。將視網膜鋪片用Tris-馬來酸緩沖液(0.05 mol/L，pH7.2)沖洗數次后，于37 ℃反應液(濃度為0.2 mol/L，pH7.2的Tris-馬來酸緩沖液中加入3 mmol/L硝酸鉛。6 mmol/L氯化鎂、1 g/L ADP)中反應15 min。再用Tris-馬來酸緩沖液(0.05 mol/L，pH7.2)沖洗15 min×5次，然后10%硫化銨顯色反應5 min。最后用Tris-馬來酸緩沖液(0.05 mol/L，pH7.2)沖洗，甘油明膠封片。

4眼球石蠟切片制作

每組17 d齡小鼠各取6只(12眼)，乙醚吸入麻醉，解剖胸腔，充分暴露心臟，將灌注針頭刺入左心室的同時用顯微剪刀剪開右心房，先用生理鹽水灌注約5 min，然后灌注4%多聚甲醛溶液約5 min。摘除小鼠眼球固定于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃過夜后，進行全層石蠟包埋，制作6 μm切片，方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位平面，每張切片的眼環中角膜所占比例均不小于1/5且包括后極部視網膜。每個眼球制作10張切片，其中2張用于免疫組化染色(分別進行SDF-1和CD14免疫組化染色)，8張用于HE染色。

5病理切片觀察和視網膜新生血管計數方法

眼球石蠟切片進行常規HE染色和中性樹膠封片后，2組各隨機抽取30張制作和染色良好的眼球切片，在Leica DM1RB顯微鏡下觀察并統計每張切片突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數，不包括玻璃體腔內其它與內界膜無聯系的新生血管芽，比較2組差異。

6SDF-1、CD14視網膜免疫組織化學染色及圖像分析

每個眼球2張石蠟切片，分別行SDF-1和CD14的免疫組化染色。常規進行SDF-1及CD14的免疫組化SABC法染色后，Leica DM1RB顯微鏡200倍下逐一拍攝切片并錄入電腦后，用ImagePro Plus準確選取切片中視網膜部分(排除眼內外其它組織以免測量誤差)，即AOI(area of interest)，測定其中積分吸光度值(integrated absorbance，IA)。計算單位視網膜面積的積分吸光度值，即IA/AOIIA。數據錄入SPSS 16.0，采用t檢驗比較組間SDF-1(和CD14)的IA/AOIIA值差異，用Spearson法對SDF-1與CD14的IA/AOIIA值相關性進行分析。

7熒光實時定量PCR檢測視網膜SDF-1mRNA含量

每組17 d齡小鼠各取6只(12眼)經頸脫臼處死后立即取出雙眼眼球，迅速沿鋸齒緣環行剪除眼前節，4 ℃生理鹽水中剝離視網膜，以同一小鼠的2個眼球的視網膜組織作為1個標本，加入1 mL Trizol后組織勻漿。常規分離抽提RNA，紫外吸收法測定RNA純度，隨后逆轉錄合成cDNA。

運用Primer Premier 5.0設計引物，SDF-1引物序列如下：上游5’-GCCAACGTCAAGCATCTGAA-3’，下游5’-TGCACACTTGTTGTCTGTTGTTGTTCT-3’。反應為40個循環(95 ℃30 s;β-actin:60 ℃ 1 min；SDF-1:55 ℃ 30 s;72 ℃ 40 s)。

結果與計算：2-△Ct為目的基因的量通過內均一化處理之后相對于參照基因的值，由機器自動生成。但為了結果表示的需要，在2-△Ct值的基礎上均擴大1×105倍。

8統計學處理

數據輸入SPSS 16.0統計學軟件進行分析。用t檢驗比較正常組和高氧組之間突破內界膜新生血管芽數目、SDF-1的平均吸光度值(IA/AOIIA)和mRNA表達量(即2-△Ct×105)、CD14的平均吸光度值之間差異。用Spearson相關分析法分析2組眼球切片SDF-1與CD14平均吸光度值的相關性。

結 果

1OIR模型的建立情況

1.1HE染色 隨機抽取正常對照組和高氧誘導組各30張眼球HE染色切片于顯微鏡下觀察。正常對照組見圖1A，其神經纖維層較薄，外叢狀層無血管，未見突破內界膜的血管內皮細胞 ；而高氧誘導組見圖1B，其神經纖維層與內界膜附近有大量的新生血管，并且血管內皮細胞突破內界膜，在視網膜前形成新生血管，圖片中黑色箭頭為突破內界膜的血管內皮細胞，白色箭頭為新生血管管腔。光鏡下正常對照組突破內界膜的新生血管芽為0個，高氧誘導組685個。正常對照組突破內界膜的內皮細胞核數與高氧誘導組比較都有顯著差異(P<0.01),表明OIR模型成功。

Figure 1. HE-stained sections of retina (×200). A:control group ; B:oxygen-induced group. Black arrows：the endotheliocyte nuclei of new vessels from retinal inner limiting membrane into the vitreous. White arrow: retinal neovascularization.

圖1視網膜HE染色圖

1.2視網膜鋪片 正常對照組和高氧誘導組小鼠的視網膜鋪片經過ADP酶染色后，置于光鏡下觀察視網膜血管形態，可見正常對照組視網膜血管發育完全成熟，自視盤向外周呈放射狀均勻分布，未見血管閉塞,見圖2A；高氧誘導組小鼠后極部視網膜見大片無灌注區，血管分支減少，大血管擴張、迂曲，中周部大量新生血管形成，見圖2B,也表明OIR模型成功。

2視網膜神經上皮SDF-1、CD14定位及半定量圖像分析

SDF-1免疫組化染色見2組視網膜切片均有棕黃色顆粒形成，主要分布于內層視網膜(以內顆粒層及神經節細胞層最為明顯)，部分血管周圍細胞也可見明顯陽性染色。CD14免疫組化染色表現同SDF-1。但需要注意的是CD14與SDF-1的陽性染色顆粒在視網膜上分布的層次相同。另外高氧誘導組SDF-1、CD14免疫組化染色的棕黃色顆粒較正常對照組顏色更深，分布范圍更大，見圖3。

通過半定量圖像分析，正常對照組SDF-1的IA/AOIIA為0.0451±0.0109；高氧誘導組SDF-1的IA/AOIIA為0.0779±0.0145。正常組與高氧組之間比較，差異顯著(P<0.01)，見圖4A。正常對照組CD14的IA/AOIIA為0.0454±0.0085；高氧誘導組CD14的IA/AOIIA為0.1021±0.0106。正常組和高氧組之間比較，差異顯著(P<0.01)，見圖4B。用Spearson相關分析法，SDF-1與CD14蛋白的IA/AOI值呈正相關(r=0.898，P<0.01)，見圖4C。

Figure 2. ADPase-stained sections of retina(×100). A:control group ; B:oxygen-induced group.

圖2視網膜鋪片圖

Figure 3. Immunohistochemistry detection of SDF-1 and CD14(×200). A: SDF-1 staining of control group; B: SDF-1 staining of oxygen-induced group; C: CD14 staining of control group; D: CD14 staining of oxygen-induced group. GCL：ganglion cell layer; IPL: inner plexiform layer; INL： inner nuclear layer.

圖3SDF-1、CD14免疫組化染色圖

3視網膜SDF-1mRNA的相對含量

將各個樣品的目的基因和管家基因分別進行real-time PCR反應。高氧誘導組2-△Ct×105值為22.545±5.630；正常組為10.021±3.150，2組間差異顯著(P<0.01)，見圖4D。

討 論

本實驗證實了OIR模型視網膜中SDF-1的表達增加。在SDF-1 mRNA水平，我們利用熒光實時定量的方法發現OIR模型小鼠視網膜中mRNA含量較正常小鼠增加。在SDF-1蛋白表達水平，我們利用免疫組化的方法，證實OIR模型視網膜SDF-1的表達以內層為主；且高氧滲導組SDF-1較正常對照組顏色更深、范圍更廣；同時結合數字圖像分析系統，用單位視網膜面積內的陽性表達累積吸光度作比較，進行了半定量分析，我們可以證實該蛋白在OIR模型中視網膜組織表達明顯增加。

Figure 4. Graphs of the content and correlation of SDF-1 and CD14. A：scatter plot of SDF-1IA/AOIIA; B: scatter plot of CD14IA/AOIIA; C：scatter plot of collection between SDF-1 and CD14;D: scatter plot of SDF-1 mRNA expression.

圖4SDF-1與CD14的含量及其相關圖

近年SDF-1(CXCRL12)/CXCR4軸參與體內新生血管生成的作用逐漸受到重視。Butler等[14]在缺血缺氧視網膜動物模型中發現，動物玻璃體內注射SDF-1中和抗體后，即使有外源性血管內皮生長因子的存在，也無視網膜新生血管的發生。此外，體外視網膜內皮細胞培養的結果還提示它可上調黏附分子(VCAM-1)的表達，而下調密封蛋白(occluding)的表達[14]。VCAM-1可促進CD14+細胞的附壁、游走，occludin減少可加重血視網膜內屏障的損傷，這些都是促進新生血管的重要因素。既往的研究通過細胞離體培養或者測定增生性視網膜病變患者玻璃體、血清中SDF-1濃度等方法來間接提示SDF-1在視網膜新生血管中作用[15, 16]，我們在實驗中直接觀察到OIR模型中視網膜內層SDF-1的表達明顯增加，無疑進一步提示該因子在視網膜新生血管發展中的地位，但SDF-1是通過何種具體機制而促進視網膜新生血管的生長？這還需要更多工作。

結合大量研究資料[10,11，17, 18]，我們推測SDF-1的促新生血管能力是通過趨化循環中CD14+細胞(如內皮祖細胞和單核/巨噬細胞)到達缺血部位而發揮作用。假如該推測正確，那么在SDF-1高表達部位應該有更多CD14+細胞的聚集。我們前面的研究已發現，OIR模型中視網膜SDF-1表達較正常視網膜明顯增加，那么CD14+細胞聚集是否也隨之增多？

我們的研究采用視網膜CD14免疫組化染色來反應CD14+細胞聚集程度，初步探討其與SDF-1之間的關系。實驗結果發現：(1)無論是在正常對照組，還是高氧誘導組視網膜中均有SDF-1和CD14的陽性染色，并且值得注意的是這2種蛋白的陽性染色在視網膜分布層次相同;(2)視網膜CD14與SDF-1的IA/AOIIA值存在正相關。假如我們的推測成立，那么受趨化的CD14+細胞所在位置應該與SDF-1表達部位相一致，并且SDF-1表達越高聚集的CD14+細胞越多。而上面兩個結果都很好地吻合我們的推測。但是根據這些研究就判定我們前面的推測成立證據尚嫌不足，初步研究結果僅僅提示了這種存在的可能性。SDF-1與CD14+細胞的確切聯系還需要進一步的研究。

我們利用免疫組化的半定量和熒光實時定量RT-PCR技術從兩方面證實，OIR模型中視網膜SDF-1的表達水平較正常老鼠明顯增加。對于其調控、應答機制的進一步研究，及其視網膜玻璃體濃度對比的動態變化研究，都有助于闡明視網膜新生血管性疾病的發病機制。

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Expressionofstromalcell-derivedfactor1inretinaswithoxygen-inducedretinalneovascularization

YUAN Fei, CHEN Xiang-wu

(DepartmentofOphthalmology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:yuanfei07@yahoo.cn)

AIM: To observe the expression of stromal cell-derived factor 1(SDF-1) in oxygen-induced retinopathy (OIR) model.METHODSThirty C57BL/6J newborn mice were randomly divided into 2 groups: 15 mice in oxygen-induced group were exposed to 75% oxygen for 5 days and to room air for another 5 days to establish the model of OIR, and the other 15 mice were kept in room air as control group. The mRNA expression of SDF-1 was determined by real-time RT-PCR. Retinal proteins of SDF-1 and CD14 were determined by immunohistochemistry.RESULTSThe numbers of the endotheliocyte nuclei in new vessels extending from retina to vitrous were lower in control group than that in oxygen-induced group (P<0.01). Positive immunohistochemical staining for SDF-1 and CD14 was found in both group, and significant differences of SDF-1 and CD14 between oxygen-induced group and control group (bothP<0.01) were observed. A strong correlation of retinal content of CD14 with the expression of SDF-1 was found (r=0.898,P<0.01). The difference of SDF-1 mRNA expression between oxygen-induced group and control group (P<0.01) was significant.CONCLUSIONThe expression of SDF-1 is increased in the retinas of OIR mice. Involvement of CD14+cells is a possible mechanism of SDF-1 in promoting neovascularization.

Models, oxygen-induced retinal neovascularization; Stromal cell-derived factor 1; CD14

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.027

1000-4718(2011)01-0139-06

2010-09-19

2010-11-11

上海市科學技術委員會科研計劃資助項目 (No.074119510)

△通訊作者 Tel：021-64041990； E-mail:15921292463@qq.com