六味地黃丸含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響*

郝艷鵬, 張 悅△, 劉煜敏, 陸 敏, 王 飛, 陸海英

(上海中醫(yī)藥大學(xué)1科技實(shí)驗(yàn)中心，2護(hù)理學(xué)院，上海 201203)

六味地黃丸含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響*

郝艷鵬1, 張 悅1△, 劉煜敏1, 陸 敏1, 王 飛1, 陸海英2

(上海中醫(yī)藥大學(xué)1科技實(shí)驗(yàn)中心，2護(hù)理學(xué)院，上海 201203)

目的觀察六味地黃丸含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞增殖及其Smad通路信號(hào)影響。方法MTT法檢測(cè)大鼠5%、10%、20%空白血清與5%、10%、20%含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響，并采用蛋白印跡法檢測(cè)10%含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞Smad通路信號(hào)分子蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果六味地黃丸含藥血清可以促進(jìn)HK-2細(xì)胞增殖；在HK-2細(xì)胞中，TGF-β1可明顯促進(jìn)Smad2蛋白的磷酸化，而10%六味地黃丸含藥血清具有明顯的抑制效應(yīng)。10%六味地黃丸含藥血清亦可促進(jìn)SnoN蛋白表達(dá)，明顯高于對(duì)照組和空白大鼠血清組。結(jié)論六味地黃丸含藥血清能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞Smad2蛋白的磷酸化，促進(jìn)TGF-β/Smad通路的負(fù)性調(diào)控因子SnoN蛋白的表達(dá)。

六味地黃丸； 腎小管上皮細(xì)胞； 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)； 蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是公認(rèn)的促纖維化細(xì)胞因子之一。在病理?xiàng)l件下，TGF-β通過(guò)其受體介導(dǎo)的Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生和發(fā)展。因此，限制和逆向調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)是治療腎纖維化的關(guān)鍵。有研究表明傳統(tǒng)中醫(yī)藥可以通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮防治腎纖維化的作用[1],而且,六味地黃丸可延緩腎組織的纖維化[6]。本研究進(jìn)一步觀察六味地黃丸含藥血清對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的TGF-β/Smad信號(hào)通路是否有逆向調(diào)控的作用？

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠(180 g±20 g)20只，清潔級(jí)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,合格證號(hào)為SCK(滬)2008-0016，上海中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按照SPF級(jí)飼養(yǎng)。

1.2藥物 六味地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，批號(hào)8074423)，取六味地黃丸200丸(每8丸相當(dāng)于生藥材量3 g)加蒸餾水約100 mL，攪拌，使之完全溶解后，濃縮其藥液至0.78 kg/L。

1.3主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，0.25%胰酶(Gibco)，青/鏈霉素注射液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Pierce )，RIPA裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，MTT(Amresco)，rhTGF-β1(Peprotech Inc.)，DMSO(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，小鼠單抗Smad2(Cell Signaling)，兔抗大鼠p-Smad2多克隆抗體(Cell Signaling)，SnoN抗體(Santa Cruz)，小鼠抗大鼠Smad7單克隆抗體(R&D)，小鼠單抗GAPDH(上海康成生物工程公司)。

1.4主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(SHEL LAB)，低溫冷凍離心機(jī)(Sigma)，超凈工作臺(tái)(上海迅博實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，倒置顯微鏡(Olympus)，電泳儀(Bio-Rad)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Biotek)，25 cm2塑料培養(yǎng)瓶(Corning)，塑料培養(yǎng)板(Corning，6孔、12孔、96孔)，微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠)。

2方法

2.1含藥血清的制備 大鼠按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組(10只)和給藥組(10只)，給藥組以生藥濃度為0.78 kg/L六味地黃丸水溶液，按10 mL水溶液/kg BW灌胃，每天2次，空白組給予同體積生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥3 d，第4 d頭次給藥1 h后腹主動(dòng)脈取血，4 ℃冷置過(guò)夜后3 000 r/min 離心15 min 分離血清， 56 ℃水浴30 min 滅活補(bǔ)體，超濾滅菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2HK-2細(xì)胞的培養(yǎng) 人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK-2，以含10%胎牛血清的DMEM/DF12培養(yǎng)液，5% CO2、 37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)。

2.3MTT法檢測(cè)不同濃度含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響 取生長(zhǎng)至80%的細(xì)胞，制成5×107cells/L的細(xì)胞懸液每孔200 μL轉(zhuǎn)種入96孔板中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至60%左右時(shí)，用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化24 h，將細(xì)胞分為5%、10%、20%正常大鼠血清(NS)組、5%、10%、20%含藥血清(MS)組以及空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μL 5 g/L MTT，37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h，吸出上清液，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩器振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處每孔的吸光度值。

2.4細(xì)胞蛋白的提取 取生長(zhǎng)至80%的細(xì)胞，制成5×107cells/L的細(xì)胞懸液，每孔1 mL轉(zhuǎn)種入12孔板中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至60%左右時(shí)，用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化24 h后分組刺激。分組如下：正常組(Ctrl)、10%正常大鼠血清組(NS)、10%含藥血清組(MS)、TGF-β1組(T)、10%正常大鼠血清+ TGF-β1組(NS+T)、10%含藥血清+TGF-β1組(MS+T)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正常組用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，NS、MS組分別用10% 正常血清和含藥血清培養(yǎng)24 h，含TGF-β1組以終濃度為5 μg/L TGF-β1刺激30 min后收獲細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷D-Hanks液洗滌12孔板細(xì)胞3次，每孔加入100 μL預(yù)冷的RIPA裂解液，反復(fù)吹打各孔細(xì)胞10 min，收集全部液體入EP管中。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一預(yù)冷的1.5 mL EP管中。取少量上清按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行定量，用上樣緩沖液將所有蛋白調(diào)至等濃度，充分混合后于100 ℃煮沸變性10 min，冰浴10 min后上樣20 μL。

2.5Western blotting法檢測(cè)HK-2細(xì)胞TGF-β/Smad通路信號(hào)分子蛋白的表達(dá) 蛋白變性后在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳中以上層膠80 V、下層膠150 V分離，然后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h后，加入Ⅰ抗4 ℃ 搖床過(guò)夜，第2 d 回收Ⅰ抗，TTBS緩沖液洗3次，每次10 min，再加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫?fù)u床孵育2 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法在X線膠片上顯影，并掃描結(jié)果條帶，測(cè)定吸光度值(absorbance,A)。

中3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1MTT法檢測(cè)不同濃度含藥血清對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響

由表1可見，與空白對(duì)照組比較，5%六味地黃丸含藥血清組，10%、20%正常血清和六味地黃丸含藥血清組A值明顯增加(P<0.05)；說(shuō)明都能促進(jìn)細(xì)胞增殖；相同濃度情況下，大鼠10%、20%正常血清和六味地黃丸含藥血清組A值比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；而5%六味地黃丸含藥血清A值明顯高于5%正常大鼠血清組(P<0.05)。

表1MTT法測(cè)定的各組HK-2細(xì)胞A值

GroupAvalueNormalserumDrug-containingserumControl0.64±0.170.64±0.175%0.68±0.160.82±0.12*#10%0.76±0.12*0.83±0.15*20%0.88±0.19*0.83±0.14*

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsnormal serum.

2Westernblotting結(jié)果

2.1Smad2蛋白表達(dá)及其磷酸化水平 各組間Smad2蛋白表達(dá)未見明顯差異，而TGF-β1刺激組Smad2蛋白磷酸化水平明顯升高(P<0.05)；與TGF-β1刺激組比較，NS+T組Smad2蛋白磷酸化水平無(wú)明顯改變，而MS+T組Smad2蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)，見圖1。

圖1各組HK-2細(xì)胞中Smad2蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的比較

2.2SnoN、Smad7蛋白的表達(dá) MS組、MS+T組均可見SnoN蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，正常大鼠血清組未見此作用；而各組間Smad7蛋白表達(dá)未見明顯差異，見圖2。

圖2各組HK-2細(xì)胞中Smad7、SnoN蛋白表達(dá)的比較

討 論

腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(tubular epithelial to menchymal transdifferentiation，EMT) 是腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生和發(fā)展的重要病理機(jī)制之一。EMT受多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素的調(diào)節(jié)，其中TGF-β是最重要的促纖維化因子,在病理?xiàng)l件下可觸發(fā)和完成EMT的全過(guò)程。Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是TGF-β1誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵通路。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β1以劑量和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)Smad2的磷酸化和向核內(nèi)轉(zhuǎn)位[2]。核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN是TGF-β/Smad信號(hào)通路中的重要負(fù)性調(diào)控因子，能夠與活化的Smad2相互作用，有效阻斷Smad依賴的啟動(dòng)子的核轉(zhuǎn)錄活性，起到阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的作用[3]。

六味地黃丸為滋陰補(bǔ)腎的經(jīng)典名方，出于宋·錢乙《小兒藥證直決》，錢氏從《金匱》腎氣丸減桂、附脫胎而成，為后世補(bǔ)劑之主方。方中熟地滋陰補(bǔ)腎、生血生精為君藥；澤瀉滲泄?jié)駶幔簧捷侨鉁仞B(yǎng)肝腎；丹皮性寒清熱兼能祛瘀活血；山藥健脾益腎，茯苓淡滲脾濕、清氣分之熱。本方用熟地、山萸肉、山藥三味補(bǔ)益肝脾腎，用澤瀉、丹皮、茯苓以泄?jié)崆鍩釢B濕，此方歷來(lái)認(rèn)為“補(bǔ)中有瀉，寓瀉于補(bǔ)，為通補(bǔ)開合之劑”，有熟地之滋補(bǔ)腎水即有澤瀉宜泄腎濁以濟(jì)之；有萸肉之溫澀吁經(jīng)即有丹皮之清瀉肝火以佐之；有山藥之收攝脾經(jīng)即有茯苓之淡滲脾濕以和之，故一直認(rèn)為六味地黃丸為“三補(bǔ)三瀉”之劑，滋陰補(bǔ)腎之主方。六味地黃丸在治療腎臟疾病方面有較為廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)代研究表明[4，5]，六味地黃湯可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，加速自由基及其代謝產(chǎn)物的消除，減輕體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，加強(qiáng)受損組織的修復(fù)。李萬(wàn)斌等[6]研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸能夠減輕5/6 腎切除大鼠殘腎組織纖維化程度，而升高M(jìn)MP-2活性，進(jìn)而減少膠原的沉積，可能是六味地黃丸治療慢性腎臟病的機(jī)制之一。六味地黃膠囊和六味地黃湯加味治療性給藥，均能改善阿霉素腎病綜合征病鼠氮質(zhì)血癥、低蛋白血癥和高脂血癥，增強(qiáng)其抗氧化能力，加速自由基及其代謝產(chǎn)物的消除，減輕體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，以及改善病鼠腎組織病理學(xué)改變等[7]。另外六味地黃丸還可以抑制大鼠衰老基因的表達(dá)，起到延緩衰老的作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)中用TGF-β15 μg/L作用于HK-2細(xì)胞30 min，誘導(dǎo)了Smad通路的激活，p-Smad2蛋白的含量比正常對(duì)照組明顯增加，而給予六味地黃丸含藥血清孵育24 h后p-Smad2蛋白的含量比模型組明顯降低，可見六味地黃丸含藥血清能夠明顯抑制TGF-β1的作用；而且六味地黃丸含藥血清能明顯促進(jìn)HK-2細(xì)胞SnoN的蛋白表達(dá)，核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN是TGF-β/Smad信號(hào)通路中的重要負(fù)性調(diào)控因子，它可通過(guò)與Smad蛋白相互作用，來(lái)抑制TGF-β1靶基因的活化，從而調(diào)控TGF-β1的生物效應(yīng)。因此，我們結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]，認(rèn)為六味地黃丸對(duì)腎小管保護(hù)作用的部分機(jī)理為抑制Smad通路的激活以及促進(jìn)該通路負(fù)性調(diào)控因子SnoN蛋白的表達(dá)。

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Effectofdrug-containingserumofLiuweiDihuangpillsonTGF-β/SmadsignalingpathwayinHK-2cells

HAO Yan-peng1, ZHANG Yue1, LIU Yu-min1, LU Min1, WANG Fei1, LU Hai-ying2

(1ExperimentCenterforScienceandTechnology,2CollegeofNursing,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China.E-mail:yuezhang_shanghai@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effect of the drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the TGF-β1/Smad signaling pathway in HK-2 cells.METHODSThe proliferation of HK-2 cell was detected by MTT method. Western blotting analysis was used to investigate the effect of the drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the protein expression of the molecules of Smad signal transduction pathway.RESULTSThe drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promoted the proliferation of HK-2 cells. The level of Smad2 phosphorylation in HK-2 cells treated with 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills was significantly lower than that in the cells treated with TGF-β1. Furthermore, SnoN, a negative factor in Smad signaling pathway, was up-regulated in HK-2 cells treated with 10% drug-containing serum.CONCLUSIONDrug-containing serum of Liuwei Dihuang pills inhibits TGF-β1/Smad signaling pathway, including reducing Smad2 phosphorylation and promoting SnoN protein expression.

Liuwei Dihuang pills; Renal tubular epithelial cells; Signal transduction; Protein expression

R285

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.029

1000-4718(2011)01-0149-04

2010-07-16

2010-10-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30371834);上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(第5期,No.J50301);上海高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目

△通訊作者 Tel:021-51322391; E-mail: yuezhang_shanghai@yahoo.com.cn