黃芩對小鼠實驗性牙周炎血清IgG1和IgG2a水平影響的研究*

黃綺凌, 宋 寧, 李東健， 黃世光△, 張增方

(1暨南大學醫學院口腔醫學系, 廣東 廣州 510632；2深圳市兒童醫院口腔科，廣東 深圳 518026；3廣州市荔灣區口腔醫院，廣東 廣州 510170)

黃芩對小鼠實驗性牙周炎血清IgG1和IgG2a水平影響的研究*

黃綺凌1, 宋 寧2, 李東健3， 黃世光1△, 張增方1

(1暨南大學醫學院口腔醫學系, 廣東 廣州 510632；2深圳市兒童醫院口腔科，廣東 深圳 518026；3廣州市荔灣區口腔醫院，廣東 廣州 510170)

目的本研究采用小鼠建立實驗牙周炎模型，觀察黃芩水提取物對牙周炎的治療效果，分析黃芩對Th1 /Th2反應平衡的作用，探討黃芩對牙周炎的免疫干預/治療機制。方法采用清潔級12周齡雄性昆明小鼠36只，隨機分成3組：(1)正常對照組；(2)牙周炎組：參照Kimura等的方法建立牙周炎模型，并于建模后第5周開始用蒸餾水灌胃；(3)黃芩組：同上法復制模型，并于建模后第5周開始用黃芩水提取物灌胃。各組動物分別于建模后第4、6和8周末處死，每組4只。制作牙體牙周組織聯合切片，觀察牙周的組織學改變，并用ELISA法檢測各組小鼠外周血清中IgG1、IgG2a水平。結果(1)組織學改變：牙周炎組牙周炎癥破壞明顯。黃芩組牙周組織炎癥程度較牙周炎組明顯減輕，修復反應明顯。(2)抗體水平：黃芩組IgG1水平逐步升高，明顯高于牙周炎組(P<0.05)。牙周炎組IgG2a水平逐步升高(P<0.05)；黃芩組IgG2a水平逐步降低(P<0.05)，且明顯低于牙周炎組(P<0.05)。結論黃芩通過抑制小鼠牙周炎的Th1細胞反應和增強Th2細胞反應增強小鼠的免疫能力，對小鼠實驗性牙周炎有顯著的治療效果。

牙周炎； 抗體； 黃芩； 免疫調節

牙周炎是一種多因素引起的牙齒支持組織的慢性感染性疾病，研究表明牙周病的病理損害與輔助性T細胞(helper T-lymphocyte, Th)免疫應答平衡失調密切相關，免疫應答向Th1方向過度發展，Th2應答相對不足致使牙周組織炎癥與牙槽骨吸收。 我們及其他一些研究者的研究表明抗牙周感染保護性免疫是一種Th2免疫反應，糾正Th1/Th2應答失衡有利于改善牙周炎的病變進程[1-3]。研究證明黃芩對慢性牙周炎具有一定的治療效果[4]，但關于其相關的免疫調節機制尚不清楚。本研究通過建立小鼠實驗牙周炎模型，觀察黃芩水提取物對牙周炎的治療效果，探討黃芩對Th1/Th2細胞反應平衡的作用，并在細胞免疫學的角度分析其免疫調節的作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

清潔級昆明小鼠購于中山大學醫學院實驗動物中心；黃芩提取物混懸液由香港大學中醫藥學院陳劍萍助理教授惠贈。

2方法

2.1動物分組 實驗采用清潔級12周齡的雄性昆明小鼠36只，體重約32-36 g，于室內采光條件良好、清潔、安靜、通風良好、室溫22℃左右、光照周期12 h∶12 h、無特殊致病菌的環境中適應性飼養1周后實驗，實驗小鼠按隨機數字表法分成3組。(1)正常對照組(normal control group)：正常喂養，牙周不做特殊處理，并于第5周開始用蒸餾水(0.2 mL/d)灌胃。(2)實驗性牙周炎組(experimental periodontitis group)：參照Kimura等[5]的方法建立實驗性牙周炎模型，于建模后5周開始用蒸餾水(0.2 mL/d)灌胃，連續觀察至第8周。(3)黃芩治療組(ScutellariabaicalensisGeorgigroup, SG)：同上法建立實驗性牙周炎模型，于建模后5周開始用黃芩提取物混懸液(0.48 g ·kg-1·d-1)灌胃，連續觀察至第8周。各組小鼠分別于建模后第4周 、第6周和第8周末，末次給藥后24 h分批處死動物，各時點每組處死動物數為4只。

2.2動物模型的建立

① 絲線結扎牙頸部 實驗小鼠用0.7%戊巴比妥鈉(0.1 mL/10 g體質量，ip)麻醉，待小鼠麻醉后，取其仰臥位，固定四肢及頭部，消毒口腔及口周，用尖探針分離雙側上頜第1磨牙牙齦組織，5/0絲線纏繞牙頸部2-3圈，于兩側牙齦乳頭處縫扎固定，在前庭溝區打結，結扎線盡量置于齦溝內。

② 牙周致病菌的接種 收集臨床確診為慢性牙周炎患者的病變區域齦緣下菌斑，置于盛有1.0 mL硫乙醇酸鹽溶液的標本瓶，在漩渦式混勻器中振蕩30 s，生理鹽水10倍系列稀釋，選擇稀釋度10-3濃度接種于疾病控制中心(CDC)厭氧血瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養5 d。將培養基上生長的菌落與牙周致病菌標準菌株對照，對符合菌種特征的菌落，用磷酸緩沖溶液 (phosphate buffer solution, PBS) 溶液洗脫、經離心收集濕菌，用培養液制成細菌懸液備用。實驗性牙周炎組、黃芩治療組小鼠經絲線結扎牙頸部后通過管飼法，每只小鼠給予菌懸液0.3 mL，初次接種后每48 h追加1次，共管飼細菌3次。

3觀察指標及檢測方法

3.1組織學觀察 取出上頜第1磨牙及其牙周組織,脫鈣,制作牙體牙周組織聯合切片, HE染色,光鏡下觀察結合上皮、上皮下炎癥細胞浸潤及牙槽骨的吸收情況。

3.2血清標本的采集和抗體的測定 采用摘眼球法采集血液約1 mL，靜置2 h，4℃放置過夜，離心(4 000 r/min)5 min，收集血清，-20 ℃保存。測量血清抗體時，將保存的標本平衡至室溫，放置20 min。ELISA法檢測 IgG1、IgG2a水平：在酶標板的反應孔中加入用0.05 mol/L pH9.6包被緩沖液稀釋至蛋白質含量為1-10 mg/L的抗原 0.1 mL，4 ℃孵育過夜。含Tween 20的5%PBS洗液洗滌4次。加入稀釋的待測血清，37 ℃放置2 h。分別用PBS與PBST洗滌2次。加入酶標抗體，37 ℃放置1 h后洗滌4次。加入底物液，37 ℃避光放置30 min。加入2 mol/L硫酸0.05 mL終止反應，在波長為450 nm處測吸光度(absorbance,A)值。

4統計學處理

結 果

1組織學改變

正常對照組牙齦上皮結構完整，結合上皮、溝內上皮結構正常，牙周膜纖維排列整齊，牙槽骨形態結構完整，見圖1A。實驗性牙周炎組牙周炎癥破壞明顯，結合上皮與牙面分離,上皮向根方增殖，組織深部可見大量炎癥細胞浸潤，血管擴張充血，牙周纖維水腫、變性，牙槽骨表面可見活躍的破骨細胞和骨吸收，牙槽嵴頂高度降低，見圖1B、C和D。黃芩組牙周組織炎性細胞浸潤比牙周炎組明顯減少，結締組織小血管增生，成纖維細胞增生活躍；骨吸收陷窩內可見成纖維細胞，偶見破骨細胞，見圖1E、F。

Figure 1. Histological changes of periodontal tissues in mice(HE staining,×10).A:normal control group.The epithelium was integrated;the structure of periodontal connective tissue was dense;the alveolar crest and alveolar bone were also integrated and had no absorption.B:periodontitis group at 4th week.Periodontium showed lots of inflammatory cells and collagen fiber edema,and the alveolar crest was blunt.C:periodontitis group at 6th week.Periodontium showed lots of inflammatory cells withcapillary injection.D:periodontitis group at 8th week.Alveolar bone was seriously destroyed.E:ScutellariabaicalensisGeorgigroup at 6th week. A small number of inflammatory cells were observed in the periodontal tissue,and fibroblasts increased.F:ScutellariabaicalensisGeorgigroup at 8th week.Fibroblasts increased with capillary hyperplasia.

圖1各組牙周組織HE染色光鏡下觀察結果

2小鼠血清抗體的變化

2.1小鼠抗體IgG1的水平 各組小鼠血清IgG1水平見表1，結果表明黃芩組和牙周炎組的抗體IgG1水平在各個時點均明顯低于正常對照組(P<0.05)；牙周炎組抗體IgG1水平逐漸降低，第8周時較第4周降低明顯(P<0.05)。黃芩組抗體IgG1水平在第4周最低，之后各時點均比第4周明顯升高(P<0.05)；第8周時黃芩組抗體IgG1水平明顯高于牙周炎組(P<0.05)。

表1各組小鼠血清IgG1水平的變化

GroupIgG1(Avalue)4weeks6weeks8weeksControl0.392±0.0060.398±0.0060.399±0.009Periodontitis0.259±0.004▲0.256±0.005▲0.245±0.008▲SG0.258±0.006▲0.314±0.006*▲△0.344±0.058★▲△

▲P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsperiodontitis group；*P<0.05vs4 weeks after operation in the same group；★P<0.05vs6 weeks after operation in the same group.SG:ScutellariabaicalensisGeorgi.

2.2小鼠血清IgG2a的水平 各組小鼠血清IgG2a水平見表2，結果表明牙周炎組抗體IgG2a水平在第6周和第8周時較第4周明顯升高(P<0.05)， 在各個時點均明顯高于正常對照組(P<0.05)。黃芩組抗體IgG2a水平逐步降低，各時點比較均有顯著差異(P<0.05)。 從第6周開始，黃芩組IgG2a水平明顯低于牙周炎組(P<0.05)。

表2各組小鼠血清IgG2a水平的變化

GroupIgG2a(Avalue)4weeks6weeks8weeksControl0.607±0.0210.614±0.0050.608±0.009Periodontitis1.208±0.014▲1.353±0.010*▲1.414±0.015★▲SG1.210±0.009▲0.934±0.006*▲△0.743±0.009★▲△

▲P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsperiodontitis group;*P<0.05vs4 weeks after operation in the same group;★P<0.05vs6 weeks after operation in the same groupSG:ScutellariabaicalensisGeorgi.

討 論

牙周病是一種多因性疾病，宿主對于微生物的入侵引發的免疫及炎癥反應是疾病發展與破壞進程的決定性因素。大量的研究表明，輔助性T細胞對免疫調節起著重要的作用。生理狀態時，輔助性T細胞亞群Th1和Th2細胞功能處于動態平衡，這種平衡對維持正常的細胞免疫功能和體液免疫功能起至關重要的作用。Th1/Th2的極化可導致機體的免疫應答偏離，引發各種疾病。牙周組織疾病時，Th1、Th2型細胞因子分泌異常，導致促炎/抑炎平衡的失調[6]。Th1細胞因子(如IL-1、IFN-γ和TNF-α)明顯高于Th2細胞因子，Th1免疫應答是牙周炎時的優勢應答反應。Th2細胞因子如IL-4、IL-10的濃度在無病灶區域及牙周治療后均顯著增加，提示Th2免疫應答與牙周狀況的改善有關[7,8]。

Th1、Th2型細胞因子與特異性抗體IgG亞類表達有重要關系。研究證實Th2細胞因子刺激抗體IgG1的產生，而Th1細胞因子則誘導產生抗體IgG2a[9]。Houri-Haddad等[10]采用小鼠皮下埋管法制作局部炎癥模型，觀察細胞因子和抗P.gingivalis的IgG抗體的水平，結果觀察到IgG1水平明顯升高，表明在牙周保護性免疫中免疫應答向Th2方向發展。在Goncalves等[11]的實驗中，采用P.gingivalis菌誘導小鼠牙周炎動物模型，觀察到IFN-γ明顯升高，血清的IgG2a抗體滴度增加，結果表明Th1型免疫反應在牙周炎發生中起主導作用。因此通過比較血清IgG2a和IgG1水平的變化，可以間接反應出Th1/ Th2細胞之間的調節變化，此方法在實驗研究中被廣泛運用[12]。在我們實驗中，觀察到小鼠牙周炎組血清抗體水平在各個時點均與正常對照組有明顯差異，牙周炎時IgG1水平降低，而IgG2a則升高，提示在牙周炎時Th2細胞反應受到了抑制，Th1細胞反應活躍，牙周炎小鼠的免疫應答向 Th1方向偏移，牙周的炎癥加重。 這個結果與我們之前的研究結果是一致的[2，3]。

黃芩含黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素等黃酮類有效成分,具有抑菌、清熱、抗變態反應等多種作用。研究證實，黃芩能抑制Th1細胞因子的過度產生。俞燕等[13]觀察到黃芩苷通過抑制IL-1β、TNF-α的過度產生從而對大鼠感染性腦水腫有保護作用。在畢新嶺等[14]的研究中，觀察到黃芩甙能明顯抑制IFN-γ，TNF-α和IL-8等細胞因子誘導成纖維細胞表達iNOS。在對牙周病治療研究中觀察到，黃芩苷能通過多種作用減少IL-1β的合成或抑制其作用[15]。在我們的實驗中觀察到，黃芩治療組隨治療時間的延長抗體IgG2a水平逐步降低；而隨治療時間延長抗體IgG1的水平逐步升高。組織學也觀察到牙周組織出現明顯的修復反應，炎性細胞浸潤減少，成纖維細胞增生活躍。我們的研究結果表明黃芩治療能使牙周炎時Th1的優勢反應受到抑制，提高Th2細胞反應，Th1/ Th2的平衡向Th2方向偏移，從而在一定程度上逆轉牙周炎Th1 /Th2細胞反應的失衡。我們的研究結果提示黃芩有可能為牙周炎的免疫治療提供一條新途徑。

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EffectofScutellariabaicalensisGeorgionserumlevelsofIgG1andIgG2ainmousemodelofperiodontitis

HUANG Qi-ling1, SONG Ning2, LI Dong-jian3, HUANG Shi-guang1, ZHANG Zeng-fang1

(1FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofStomatology,ShenzhenChildren’sHospital,Shenzhen518026,China;StomatologicalHospitalofLiwanDistrict,Guangzhou510170,China.E-mail:thshg@126.com)

AIM: To investigate the effect of the water extract ofScutellariabaicalensisGeorgion the experimental mouse model of periodontitis.METHODSThirty-six male Kunming mice (SPF grade and 12 weeks old) were randomly divided into 3 groups: (1) normal control group; (2) experimental periodontitis group: The animals were prepared by ligature of braided silk around the first maxillary molars, inoculated with putative periodontopathic baeteria,and then gavaged with distilled water at the beginning of the 5th week after the ligature; (3)ScutellariabaicalensisGeorgigroup(SG group).The periodontitis model animals were induced by the same way as above, then were gavaged with the water extract ofScutellariabaicalensisGeorgiat the beginning of the 5th week after the ligature. The mice were sacrificed at the end of 4, 6 and 8 weeks after the model of periodontitis was established. The histological changes of periodontal tissues were observed under microscope with HE staining. The serum levels of IgG1 and IgG2a were determined by ELISA.RESULTSThe results of histological observation showed that the destruction of periodontal tissue in periodontitis group was more serious than that in other groups. Lots of inflammatory cells were observed in the deeper periodontal tissue. Osteoclastic resorption was observed on the surface of alveolar bone, and the height of alveolar bone decreased. The level of IgG1 in SG group increased and was significantly higher than that in periodontitis group at week 6 and week 8 (P<0.05). The level of IgG2a in periodontitis group also increased (P<0.05). However, the level of IgG2a in SG group decreased and was significantly lower than that in periodontitis group (P<0.05).CONCLUSIONThe water extract ofScutellariabaicalensisGeorgiplays a significant role in mouse periodontitis by restraining Th1 response and strengthening Th2 response.

Periodontitis; Antibodies;ScutellariabaicalensisGeorgi; Immunoregulation

R781.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.033

1000-4718(2011)01-0171-04

2010-08-09

2010-10-09

廣東省中醫藥局建設中醫藥強省科研課題資助項目 (No. 2008315 )

△通訊作者 Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com