HA/ZrO2復合材料顆粒的體外基因毒性的初步研究*

全仁夫, 湯樣華, 楊迪生, 黃忠名, 李 偉, 徐金渭, 吳曉春

(1 蕭山中醫院骨科，浙江 蕭山 311200； 2浙江大學附屬第二醫院骨科，浙江 杭州 310009； 3上海大學材料學院, 上海 200072)

·短篇論著·

HA/ZrO2復合材料顆粒的體外基因毒性的初步研究*

全仁夫1△, 湯樣華1, 楊迪生2, 黃忠名1, 李 偉1, 徐金渭1, 吳曉春3

(1蕭山中醫院骨科，浙江 蕭山 311200；2浙江大學附屬第二醫院骨科，浙江 杭州 310009；3上海大學材料學院, 上海 200072)

目的采用體外微核法評價HA/ZrO2復合材料顆粒的基因毒性。方法按不同比例將羥基磷灰石與二氧化鋯粉體混合在高溫高壓下燒結制備HA/ZrO2復合材料顆粒，純HA和純ZrO2顆粒作為對照。制備復合材料顆粒的懸液，分離和培養兔間充質干細胞。MTT法檢測復合材料顆粒懸液對兔間充質干細胞增殖促進作用，體外微核試驗(MNT) 檢測復合材料顆粒懸液對兔間充質干細胞的基因毒性。結果MTT實驗顯示：純HA和含HA的復合材料顆粒均對間充質干細胞增殖有一定促進作用，而純ZrO2顆粒對間充質干細胞增殖沒有促進作用，差異顯著(P<0.05)。MNT實驗顯示：HA組與陰性對照組相比差異不顯著(P>0.05)，與陽性對照組比差異顯著(P<0.05)； ZrO2組與陰性對照組比差異顯著(P<0.01)，與陽性對照組比差異不顯著(P>0.05)。結論HA/ZrO2復合材料顆粒的基因毒性隨著ZrO2比例和復合材料濃度的增加而增加，30%wtHA/70%wtZrO2在200 mg/L時具有顯著基因毒性(P<0.01)。

鋯; 羥基磷灰石類; 復合材料; 基因毒性

生物材料屬于永久性的植入材料,必須具有良好的生物相容性。任何一種新型生物材料在臨床使用前,都必須進行生物相容性檢測,包括組織學、細胞學、基因及分子學等不同水平的生物學評價。其中,基因毒性主要包括基因突變、染色體異常或基因組的改變,其檢測可通過體外及體內實驗進行,其中體外實驗由于操作方便及代表性強而多用作初步篩選實驗。細胞水平的基因毒性主要表現為染色體量及結構的異常,體外微核法(micronucleus testinvitro,MNT)是最常用于檢測染色體異常的實驗方法。本研究按國家標準GBPT16886 醫療器械生物學評價[1]的要求,擬通過體外微核法對新型生物復合材料-HA/ZrO2梯度復合材料的體外基因毒性進行初步評價,為其應用于臨床的可行性做進一步的驗證。

材 料 和 方 法

1材料

1.1HA/ZrO2復合材料顆粒的制備 由上海大學高分子材料研究所制備。(1) 納米羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)粉體的制備：將Ca(NO3)2溶解在95%的乙醇中，制成0.5 mol/L的溶液，(NH4)2HPO4溶解于去離子水中，制成0.5 mol/L的溶液；用氨水調節2種溶液的pH值為10，各加入5滴乙醇胺；在劇烈攪拌下，先將少量的(NH4)2HPO4加入到Ca2+溶液中，使溶液中產生HA晶核，然后將(NH4)2HPO4溶液全部倒入Ca2+溶液中；反應溫度為25 ℃，控制pH值為10，攪拌一段時間，陳化12 h；然后用99.7%乙醇洗滌3次，用微波爐快速干燥，最后在700 ℃焙燒1 h，得到HA粉體。(2)納米ZrO2粉體的制備：配制含給定Y3+/Zr4+比率的氯化釔(Y2O3+HCl)和氯氧化鋯的混合溶液(上海化學試劑廠)，HCl濃度控制在0.2 mol/L，鋯鹽濃度選取1.0 mol/L。將混合溶液徐徐加入氨水中，并不斷攪拌，保持體系pH值9-10，靜止沉淀后得到共沉淀物。將共沉淀物過濾，用蒸餾水洗滌，去除氯離子(<10 mg/L)；再用99.7%乙醇洗滌至少6次，去除H2O(使水含量小于4 vol%)。干燥后得到疏松的氫氧化物前驅劑。經750 ℃煅燒2 h后，得到3.0 mol/LY2O3穩定的ZrO2(Y2O3)超細粉末。(3)HA/ZrO2復合材料粉體的制備：按照不同比例將納米HA粉體與納米ZrO2粉體配備而成(具體配方設計見表1)，將混合顆粒放入剛玉坩鍋中，置于立式硅鉬棒爐內常壓下燒結，加熱至1 600 ℃保溫3 h，隨后燒結體在爐內隨爐冷卻到室溫后取出。

表1不同比例復合材料粉體的配方設計

Table 1. The recipe formulation of the different proportions of the composite particles

RecipeZrO2(%wt)HA(%wt)1010023070350504703051000

1.2復合材料顆粒懸液的制備 復合材料顆粒經高溫高壓消毒滅菌,DMEM培養基經濾過除菌,將材料粉、液振蕩混勻后在細胞培養孵箱中37 ℃放置7 d，離心后取出上清液，再進行梯度稀釋，濾過除菌后備用。

2主要試劑

淋巴細胞分層液(上海生化試劑廠)，RPMI-1640培養液(Gibco)，胎牛血清DMEM培養液(杭州四季青生物公司)，MTT試劑盒(碧云天公司)，Giemsa染液(上海生化試劑公司)，絲裂霉素(Sigma)。

3間充質干細胞的分離培養及鑒定

新西蘭兔經3%戊巴比妥鈉1.5 mL/kg腹腔注射麻醉后，以8%硫化鈉去除脛骨近端被毛。術野經碘伏及75%乙醇消毒后，以骨髓穿刺針從脛骨結節外側穿刺，穿刺針旋轉刺入髓腔，接5 mL注射器(注射器內預留肝素鈉2 000 U)，抽取骨髓液3-4 mL。吸出的骨髓液緩慢注入預先加入4 mL淋巴細胞分層液的試管內,密度梯度離心,2 500 r/min離心30 min, 離心后吸取中間的單個核細胞層，PBS洗1次，以3×105cells/cm2的密度接種于25 cm2培養瓶內，加15%胎牛血清DMEM培養液3 mL(含青霉素鈉1×105U/L，鏈霉素100 mg/L，pH 7.2-7.4)。在5%CO2孵箱內37 ℃培養。48 h后棄除未貼壁的細胞，3-5 d后半量換液。繼續培養且全量每周換液2次。待細胞長滿底面后, 用0.25%胰酶消化5 min,即得到原代間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)懸液, 再以1×104cells/cm2的密度傳代培養。

3.1繪制細胞生長曲線圖 從第1 d起，取貼壁細胞消化成單細胞懸液后，每天各取3孔計數，每孔計數3次，計算均值，連續6 d，描繪生長曲線。觀察骨髓間充質干細胞生長狀況。

3.2流式細胞術鑒定 取培養的骨髓間充質干細胞，經2.5 g/L 胰蛋白酶和1 mmol/L EDTA消化后，加入含1%小牛血清的PBS，調整細胞濃度至1×1010cells/L，分別加入CD45-PE、CD54-PE和CD90-FITC小鼠抗大鼠單克隆抗體，4℃孵育30 min，PBS清洗后進行流式細胞術分析鑒定。

4細胞毒性實驗(MTT cytotoxicity test)

將第3代間充質干細胞以1×104cells/cm2密度種植于24孔板，將HA/ZrO2復合材料懸浮于培養液中配制成不同濃度的材料顆粒懸液(0、50、200 mg/L)將0.5 mL不同濃度的材料懸液加入到24孔板中，每種濃度重復6孔。5 d后以PBS洗去培養液及顆粒，每孔細胞樣本加入100 μL 20%MTT，37 ℃孵育4 h后，吸棄孔內液體，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，用酶聯檢測儀在490 nm波長下檢測吸光度值。

5體外微核實驗

本實驗分為實驗組、陽性對照組和陰性對照組, 將MSCs以2×104cells/cm2接種于6孔板，培養至70%-80%覆蓋底面,實驗組在培養液中加入不同材料和濃度的材料懸液；陽性對照組在培養液中加入0.5 mg/L的絲裂霉素；陰性對照組只加入培養液,不加入任何材料或絲裂霉素。 48 h后各組細胞棄去培養液,消化后2 000 r/min離心10 min獲得細胞團塊，棄上清液，加入預溫至37 ℃的0.1 mol/L KCl溶液，在溫箱中靜置10 min，向懸液中加新鮮1∶3冰醋酸、甲醇固定液，1/5體積于KCl，吹勻，離心吸除上清液，加新鮮固定液2-3 mL；輕輕吹勻，靜置5 min，再離心后，吸除上清，據細胞數量，添加固定液0.1-0.5 mL滴片，Giemsa染色10 min，水洗、晾干、在顯微鏡下觀察并計算微核的數目。

6統計學處理

結 果

1骨髓間充質干細胞的形態觀察、生長曲線及表型鑒定

將用密度梯度法分離的細胞接種于培養瓶中，鏡下可見大量懸浮的細胞，接種24 h后便有少量的細胞貼壁, 多為梭形或成纖維細胞樣，經換液后，非貼壁細胞逐漸減少，貼壁細胞逐漸呈克隆樣生長，約10 d后，細胞逐漸融合，呈放射樣、爆花樣或漩渦樣。細胞長滿瓶底約需10-15 d。傳代培養細胞生長穩定,約3-4 d傳代1次。隨著不斷傳代細胞可以得到純化。可傳20代以上。MSCs以1×104cells/cm2接種時4 d可長滿瓶底，傳1代細胞可擴增4倍。增殖倍增時間約為24 h,見圖1。

Figure 1. Growth curve of the MSCs.

圖1骨髓間充質干細胞的生長曲線

流式細胞儀檢測結果顯示，MSCs高表達CD90和CD54，陽性率分別為94.8%和95.9%，低表達CD45，陽性率僅為12.7%。

2細胞毒性實驗

結果顯示：HA和含有HA的復合材料顆粒均對細胞增殖有一定促進作用，而單純ZrO2顆粒對細胞增殖沒有促進作用，HA組與ZrO2組比差異顯著(P<0.05,n=6)，見圖2。

圖2HA/ZrO2復合材料顆粒細胞毒性實驗

3微核實驗

圖3顯示HA組與陰性對照組差異不顯著，與陽性對照組差異顯著，提示HA不具有基因毒性；ZrO2組與陰性對照組比較差異顯著，與陽性對照比較差異不顯著，提示ZrO2具有一定基因毒性。HA/ZrO2復合材料的基因毒性隨著ZrO2比例和復合材料濃度的增加而增加，30%HA/70%ZrO2在200 mg/L時有顯著的基因毒性。

圖3復合材料顆粒懸液體外微核實驗結果差異比較

討 論

隨著生物材料的不斷涌現,對生物材料的毒理研究也日益受到重視。作為長期存留于體內的生物材料,其生物相容性的好壞將直接影響復合材料對周圍組織的修復反應。除了細胞及組織毒性的研究外,復合材料的基因毒性也被認為是評價新型材料的必須步驟[2]。微核實驗是反映染色體損傷的重要實驗方法，已廣泛應用于遺傳、食品、藥物、環境等多領域的遺傳毒性評估。但國內學者將其應用于生物支架材料基因毒性檢測的文獻報道不多，體外微核法作為檢測基因毒性用于毒理研究已得到公認, 微核實驗最大的優點是經濟、簡單、快速。微核是指位于細胞漿中獨立于主核的核小體，主要由外界損傷因素作用細胞后，導致細胞染色體丟失或斷裂，從而在胞漿中形成1個或數個小核，可選用的細胞系很廣泛，如人淋巴細胞、大小鼠外周血和骨髓紅細胞、生殖細胞、口腔黏膜細胞、肝細胞、中國倉鼠肺成纖維細胞、植物(包括紫露草和蠶豆)細胞等。故體外微核法已成為新型生物支架材料臨床應用前生物相容性研究中不可缺少的一部分。大量研究表明，體外微核法對于檢測新材料的基因毒性有很好的敏感性和特異性,且簡單易行、可自動化計數及重復性好[3-5]。利用特殊的細胞系,它可敏感地表現在材料的影響下細胞所發生的染色體結構和數量上的異常變化。MSCs是一類具有分化潛能的細胞,在特定條件下可以分化為多種組織細胞,如成骨細胞、軟骨細胞、肌腱、脂肪細胞、成纖維細胞以及神經星狀細胞等,且具有極強的自我復制能力, 是一種重要組織工程種子細胞[6-9]。當其接觸有基因毒性的材料時,其染色體分裂發生障礙,出現染色體的斷裂或滯后,導致在分裂后期染色體不能正常分配到子代細胞中,從而表現出細胞質中的染色體樣物質-微核,通過微核數量的多少可判斷出材料的染色體毒性[10]。本實驗采用了材料的顆粒懸液來評價材料的基因毒性,本實驗為了避免其它化學提取液本身對MSCs作用的干擾,采用了細胞培養基作為材料的浸提液。在毒理實驗中,通常需在進行基因毒性實驗前先進行細胞毒性實驗,以確定實驗材料抑制細胞生長的濃度,再選其范圍內的濃度作為基因毒性的實驗濃度。在進行基因毒性實驗時,我們采用了高濃度作為實驗濃度參照，體外微核實驗結果顯示，HA組與陰性對照組差異不顯著, 而陰性對照組僅為間充質干細胞培養基，與陽性對照組差異顯著，說明HA不具有基因毒性；ZrO2組與陰性對照組差異顯著,與陽性對照差異不顯著， 說明ZrO2具有一定基因毒性。HA/ZrO2復合材料的基因毒性隨著ZrO2比例和材料濃度的增加而增加。30%HA/70%ZrO2在200 mg/L時具有顯著基因毒性。HA/ZrO2復合材料的基因毒性隨著ZrO2比例的增加而增加，這可由材料的成分比例的不同得到解釋。本研究中用于制備生物復合材料的2種原材料ZrO2和HA均為用于臨床及實驗研究多年的材料，其生物相容性均得到公認[11-13]。而且在前期的研究中也已證實作為兩者復合物的新型生物復合材料―HA/ZrO2梯度復合材料也具有良好的生物相容性和生物活性、無細胞毒性等[14]。本實驗的結果為該材料應用于臨床提供了進一步的客觀評價分析。

Figure 4. Giemsa dyeing of the micronucleus formed in each experimental group. Arrows indicate the micronuclei,the intracytoplasmic dyed objects. A: amplified figure of the micronucleus. B: negative control; C: positive control; D: pure HA group; E: 70%HA composite group; F: 50%HA composite group; G: 30%HA composite group; H: pure ZrO2group, 200 mg/L.Bar=10 μm.

圖4各實驗組所形成的微核Giemsa染色

[1] 孫 皎.生物材料和醫療器械生物學評價[J].中國醫療器械雜志,2003,27 (1):1- 3.

[2] Heil J, Reifferscheid G, Waldmann P, et al. Genotoxicity of dental materials[J]. Mutat Res, 1996，368(3-4): 181-194.

[3] Kocaman AY, Topaktas M.Invitroevaluation of the genotoxicity of acetamiprid in human peripheral blood lymphocytes[J]. Environ Mol Mutagen, 2007，48(6): 483-490.

[4] D?nmez-Altuntas H, Dumlupinar G, Imamoglu N, et al. Effects of the mycotoxin citrinin on micronucleus formation in a cytokinesis-block genotoxicity assay in cultured human lymphocytes[J].J Appl Toxicol, 2007，27(4): 337-341.

[5] Miller B, Potter-Locher F, Seelbach A, et al. Evaluation of theinvitromicronucleus test as an alternative to theinvitrochromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on theinvitromicronucleus test[J]. Mutat Res, 1998,410(1): 81-116.

[6] Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues[J]. Science, 1997, 276(5309): 71-74.

[7] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science, 1999,284(5411):143-147.

[8] 王躍春，張 洹.人胎肝MSCs的分離培養及其類ESCs特性的研究[J].中國病理生理雜志,2009,25(2):409-412.

[9] 李映紅,吳正治,吳偉康,等.天然腦活素定向誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經元樣細胞分化的實驗研究[J].中國病理生理雜志,2009,25(8):1548-1553.

[10]Schweikl H, Schmalz G. The induction of micronuclei in V79 cells by the root canal filling material AH plus[J]. Biomaterials, 2000,21(9):939-944.

[11]全仁夫，楊迪生，吳曉春，等.二氧化鋯梯度復合羥基磷灰石生物陶瓷的制備及其體外免疫相容性[J].生物醫學工程學雜志,2006,23(5):1056-1061.

[12]全仁夫，楊迪生，苗旭東，等.二氧化鋯梯度復合羥基磷灰石生物材料對大鼠成骨細胞體外活性的影響[J].中華創傷雜志,2006,22(11):852-857.

[13]張 敏，汪宏斌，全仁夫，等.羥基磷灰石-二氧化鋯生物復合材料的制備及其生物相容性[J].復合材料學報,2006,23(2):115-121.

[14]全仁夫，楊迪生，苗旭東，等.二氧化鋯梯度復合羥基磷灰石的生物相容性研究[J].中國修復重建外科雜志,2006,20(5):569-573.

PreliminarystudyofgenotoxicityofHA/ZrO2compositeparticlesinvitro

QUAN Ren-fu1, TANG Yang-hua1, YANG Di-sheng2, HUANG Zhong-ming1, LI Wei1, XU Jin-wei1, WU Xiao-chun3

(1DepartmentofOrthopedics,XiaoshanTCMHospital,Xiaoshan311200,China;2DepartmentofOrthopedics,SecondAffiliatedHospitalofZhejiangUniversity,Hangzhou310009,China;3MaterialCollegeofShanghaiUniversity,Shanghai200072,China.E-mail:quanrenf@263.net)

AIM: To evaluate the genotoxicity of the hydroxyapatite/ZrO2(HA/ZrO2) composite particles by using theinvitromicronucleus test (MNT).METHODSThe HA/ZrO2composite particles prepared by sintering at high temperature and pressure using the powder of HA and ZrO2with different proportions were compared with the pure HA particle and pure ZrO2particle. The suspension of the composite particles was made. The rabbit mesenchymal stem cells were isolated and cultured. The promotive effect of the composite particles on the proliferation of the rabbit mesenchymal stem cells was detected by MTT method. The genotoxicity of the composite particles to the rabbit mesenchymal stem cells was measured by MNT method.RESULTSThe MTT test showed that both of the pure HA particle and the composite particles containing HA promoted the proliferation of rabbit mesenchymal stem cells. However, no promotive effect of the pure ZrO2particle on the proliferation of rabbit mesenchymal stem cells was observed. The MNT test showed no significant difference between HA group and negative control group (P>0.05), and significant difference between HA group and positive control group (P<0.05). The difference between ZrO2group and negative control group was significant (P<0.01), and the difference between ZrO2group and positive control group was insignificant (P>0.05).CONCLUSIONThe increase in genotoxicity of HA/ZrO2composite particle is dependent on the proportion of ZrO2and the concentration of the composite. The 30%wt HA/70%wt ZrO2composite at the concentration of 200 mg/L shows significant genotoxicity.

Zirconium; Hydroxyapatites; Composite materials; Genotoxicity

R318

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.034

1000-4718(2011)01-0175-04

2010-05-09

2010-09-29

浙江省醫學科研基金資助項目(No.2007A170);杭州市科技發展計劃資助項目(No.20080333B23)

△通訊作者 Tel: 0571-82727212； E-mail:quanrenf@263.net