ROS介導的自噬及其在相關疾病中的作用*

尤壽江, 石際俊, 張艷林, 劉春風，2△

(蘇州大學1附屬第二醫院神經內科，2神經科學研究所衰老與神經疾病實驗室，江蘇 蘇州 215004)

·綜述·

ROS介導的自噬及其在相關疾病中的作用*

尤壽江1, 石際俊1, 張艷林1, 劉春風1，2△

(蘇州大學1附屬第二醫院神經內科，2神經科學研究所衰老與神經疾病實驗室，江蘇 蘇州 215004)

傳統觀念認為，活性氧類(reactive oxygen species，ROS)只是一類損傷細胞的毒性物質，近年的研究發現ROS作為一種信號分子參與細胞的增殖、分化及凋亡等多個生理過程。自噬是一種溶酶體依賴性的細胞內大分子物質和細胞器的降解過程，不僅在生理情況下發揮重要作用且參與一些疾病的發生發展[1-3]。最新的研究表明ROS，特別是線粒體源性ROS，作為信號分子參與自噬的調節。本文集中討論了ROS和自噬的關系以及ROS介導的自噬在疾病發生發展中的作用，從而為疾病的治療提供新的靶點和策略。

1 ROS和氧化應激

如果胞內抗氧化物質不能夠有效降解ROS，就使得ROS在胞內蓄積從而引起氧化應激[4]。蓄積的ROS氧化胞內的DNA、蛋白、脂質及細胞器。被ROS氧化的蛋白及脂質不僅失去應有的功能而且易于在胞內聚集，形成脂褐素等毒性物質，并通過影響溶酶體的活性而引起細胞死亡[5]。另外，氧化應激也引起線粒體的嚴重損害，線粒體內積聚的ROS可以使其DNA突變、脂質過氧化以及線粒體膜通道的開放，從而影響線粒體的功能。氧化導致的線粒體膜滲透性通道的開放導致線粒體膜的通透性增加，引起線粒體內ATP及Ca2+含量下降，致使線粒體腫脹及細胞色素C的釋放。研究認為線粒體此種嚴重的損害可以引起自噬、自噬性細胞死亡、凋亡和壞死[6]。

2 自噬

自噬是生物體通過溶酶體或囊泡降解胞內成分的總稱[7]，不但在細胞的分化和成熟過程中起重要作用，而且在應對各種應激時也發揮著關鍵作用。

自噬主要有3種形式：大自噬(macroautophagy)即所謂的自噬、小自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。大自噬通過雙層膜結構包裹胞漿內物質，如蛋白及細胞器，形成自噬囊泡，自噬體的外膜或者液泡膜與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體, 溶酶體內的水解酶最終降解其包裹的底物。小自噬是溶酶體膜通過內吞作用直接包裹胞漿內物質。CMA途徑只能選擇性降解帶有特定信號基序賴-苯丙-谷-精-谷氨酰胺序列(KFERQ)的胞漿蛋白，胞漿內的伴侶蛋白特異性地識別這種信號基序然后與溶酶體膜上的受體溶酶體結合性膜蛋白2a (lysosome-associated membrane protein 2a，Lamp2a)結合從而將底物轉運到溶酶體內降解[8]。

盡管，自噬最初被認為是非選擇性的降解過程，但目前的研究認為自噬可以通過優先降解胞內過多的細胞器即選擇性自噬，如過氧物酶體自噬(pexophagy)、內質網自噬(reticulophagy)[4]和線粒體自噬(mitophagy)[9]等，從而在機體應對各種應激過程中發揮重要作用。其中和氧化最密切的是線粒體自噬。

3 自噬在機體應對氧化應激過程中的雙重作用

近年，自噬既可以保護細胞又可以引起細胞死亡的雙重作用已被人們廣泛接受[10，11]。同樣，在氧化應激時自噬也發揮著雙重作用。在應對氧化應激損傷時，機體會產生多種防御機制：上調抗氧化劑的水平、通過泛素蛋白酶體系統來降解特定的蛋白、通過自噬來降解已損傷的蛋白和細胞器[12]。

一方面自噬的優先激活通過清除氧化的蛋白及損傷的細胞器而有利于細胞的存活。過多的ROS及其它物質可以通過優先激活線粒體自噬選擇性地降解氧化損傷的線粒體，從而減輕其對細胞的損害[9]。過多的ROS可以誘導及加強CMA途徑對氧化蛋白的清除，因為氧化的蛋白相比未氧化的蛋白更易通過分子伴侶轉運到溶酶體內，而且在較弱的氧化應激情況下溶酶體更易結合及轉運CMA底物蛋白，從而有利于細胞存活[13]。同樣自噬在清除正常衰老細胞中過多氧化的蛋白發揮重要作用，但隨著年齡的增長自噬的活性下降，不能夠有效地清除氧化的蛋白，導致衰老及一些老年性疾病，如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、糖尿病等的發生[13]。

另一方面自噬可以直接誘導被氧化細胞的死亡。以往的研究認為，在氧化應激較強時，凋亡和壞死的機制就會被激活從而誘導細胞死亡[14]。

4 ROS在自噬激活中的作用

4.1ROS作為一個信號分子參與細胞的自噬性死亡 ROS作為一種胞內信號分子參與胞內許多生物過程，參與細胞增殖、凋亡、免疫及抗微生物過程[15]。在神經生長因子(nerve growth factor， NGF)缺乏情況下，ROS第一次被證實作為一種信號分子參與神經細胞的自噬性細胞死亡(autophagic cell death，ACD)[16]。NGF的缺陷導致大量ROS在神經元線粒體內蓄積，ROS通過引起線粒體膜脂質過氧化，線粒體功能異常，最終引起自噬性細胞死亡[17]。通過敲除自噬關鍵基因beclin1和自噬相關蛋白7(Atg7)，發現NGF缺陷導致細胞死亡減少，進一步明確自噬參與其中，且證明H2O2是誘導這種自噬性死亡有效而且必需的。應用抑制線粒體氧化呼吸鏈的藥物如魚藤酮可以使線粒體內產生過多的ROS引起自噬性細胞死亡[18]。以上研究表明ROS作為信號分子通過誘導自噬參與了細胞的死亡。目前還并不清楚具體參與這些自噬性細胞死亡的ROS，但有學者認為可能有多種ROS同時參與其中，如O2和H2O2[18]。

研究發現自噬的激活又可以加劇ROS的蓄積[19]。Caspase抑制劑可以導致自噬選擇性地優先降解過氧化氫酶，導致線粒細胞內ROS蓄積并最終引起細胞死亡。通過ROS蓄積和自噬之間反饋環路的假說可以解釋這一現象：低水平的ROS激活自噬，自噬的激活降解過氧化氫酶反過來又可以增加H2O2的水平，H2O2的增加進一步激活自噬。這些結果表明，過氧化氫酶的降解或許導致H2O2信號的延長，在自噬性存活向自噬性死亡轉化過程中起重要作用。

4.2ROS參與細胞的自噬性存活 最近的研究發現ROS也參與饑餓誘導自噬的調節，而這種自噬的激活有利于細胞的存活。在饑餓時，通過Ⅲ型PI3K-mTOR途徑引起線粒體內H2O2蓄積從而激活自噬[20]。

饑餓誘導的氧化信號在饑餓的早期就會出現，H2O2通過氧化底物自噬相關蛋白4(Atg4)發揮作用。Atg4是自噬途徑中不可缺少的蛋白之一，其功能是切割泛素樣蛋白家族自噬相關蛋白8(Atg8)蛋白的c末端，Atg8是一個與自噬溶酶體膜上的磷脂酰乙醇胺結合的必不可少的物質。Atg4只能切割與溶酶體膜共價結合的Atg8，切割形成的游離的Atg8在胞漿中可以循環利用[13]。而氧化的Atg4則不能夠切割與溶酶體膜共價結合的Atg8從而誘導自噬的激活。在這個過程中Atg4是ROS誘導自噬性細胞存活信號通路中的一個中間物質。進一步的研究認為H2O2相比其它ROS信號更有優勢：H2O2相對穩定、壽命長及作為一種中性離子更易通過線粒體膜。然而，仍然不清楚的是在這條途徑中Atg4是否是H2O2的唯一底物？Atg4的抑制僅存在于饑餓誘導的自噬還是存在于所有的自噬途徑中?

既然ROS 參與了自噬的調節，那么ROS信號的來源是什么呢？目前的研究認為參與自噬調節的ROS主要來源于線粒體。ROS的產生和降解之間平衡的破壞是線粒體內ROS 聚集的主要原因。大量研究表明，線粒體產生的ROS可以誘導自噬：(1)應用rotenone、4，4，4-三氟-1-[2-噻吩]-1-3-丁烷二酮(thenoyltrifluoroacetone，TTFA)、H2O2或2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)等抑制線粒體膜的呼吸鏈復合體可以誘導線粒體內ROS蓄積，從而引起細胞的自噬性死亡[18]；(2)雷帕霉素和神經生長因子(nerve growth factor， NGF)缺乏使得線粒體膜脂質氧化從而上調自噬[21]；(3)營養缺陷誘導ROS蓄積所致的自噬激活也與線粒體密切相關[19]。因此，我們推測線粒體可以作為誘導自噬的氧化還原信號的來源。

4.3線粒體在自噬體形成中的作用 線粒體可以通過產生ROS調節自噬體的形成，然而其對自噬的調節是否只能通過ROS產物起作用呢？有研究顯示，在酵母中自噬相關蛋白9(Atg9)(與自噬相關的兩個胞膜內蛋白之一)在前自噬溶酶體結構及其周圍結構之間循環，這表明自噬體形成過程中存在膜成分的循環利用；同時位于周圍的Atg9活性結構存在于線粒體附近[22]。已明確哺乳動物細胞內的兩個Atg9亞型且這兩個亞型都參與自噬溶酶體膜的合成，同時線粒體也參與其中[23]。

據以上的研究可知線粒體是自噬誘導信號ROS的主要來源之一，同時可能還提供部分自噬溶酶體膜合成的原料[24]。線粒體來源的ROS轉運到胞漿產生一個氧化梯度，同時氧化其底物分子如Atg4及一些未知的分子，氧化的Atg4失去活性不能切割自噬溶酶體膜結合的Atg8，從而誘導自噬的激活。因為ROS是一類短壽命的物質，氧化過程只能在線粒體周邊，而在遠離線粒體的Atg4具有活性并可以分離位于自噬體上的底物Atg8使其參與循環利用。然而，目前還沒有儀器能夠檢測氧化梯度的變化從而證實這種推測。

5 ROS介導的自噬與疾病

ROS介導的自噬不僅與正常的老化相關，而且可以直接導致或加劇一些疾病的發生發展。一些與氧化有關的疾病中溶酶體系統功能受損起重要作用，如動脈粥樣硬化、AD和PD。雖然這些疾病在后期階段有著共同類似的改變即未消化物質在溶酶體內蓄積，但最初的氧化蛋白進入溶酶體的途徑各不相同[12]。

5.1ROS介導的自噬與動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化斑塊源自血管系統內溶酶體應對氧化損傷的反應。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)轉運膽固醇聚集到動脈壁內，隨后巨噬細胞遷移到膽固醇積聚的位置通過溶酶體來包裹清除氧化的蛋白[25]。最后巨噬細胞內溶酶體堿性化導致溶酶體內未降解物質的積聚，巨噬細胞充滿了超載的溶酶體，成為吞噬活性有限的“泡沫細胞”。研究表明氧化的膽固醇及ROS在動脈粥樣硬化的進展中發揮重要作用，氧化的膽固醇通過損傷溶酶體從而影響自噬對于泡沫細胞的清除[26]，而ROS隨著損傷細胞及胞外碎片的積聚而增加，從而使病變一直存在。我們的課題組通過培養人臍靜脈內皮細胞證實大自噬確實參與對ox-LDL的降解，在動脈粥樣硬化的形成中起著重要的作用[27]。

5.2ROS介導自噬和阿爾茨海默病 AD是老年人最常見的神經退行性疾病，它的病理學特征為胞內具有毒性的肽片段Aβ-42的聚集。研究表明在Aβ-42聚集的早期就發現有大自噬的激活，并作為一種保護性機制阻止細胞進一步損害[28]。隨著疾病的進展一方面自噬的活性下降且自噬溶酶體的融合障礙；另一方面Aβ-42抑制溶酶體的降解功能使聚集很快達到毒性水平，導致溶酶體內產生ROS。而過多的ROS可以抑制自噬體對其內物質的降解從而加劇內容物的積聚，使溶酶體膜內外的質子梯度改變并引起細胞死亡[29]。盡管ROS參與了自噬介導的細胞死亡，但其在AD發病中的具體機制仍有待于進一步闡明。

5.3ROS介導的自噬與PD PD是以黑質致密部和紋狀體多巴胺能神經元內出現主要含有聚集α-synuclein的包涵體-Lewy小體為病理標志的神經變性疾病。多巴胺非常容易被氧化，胞內和胞外實驗證實DA的氧化與α-synuclein的積聚相關。大量研究表明，自噬參與了α-synuclein的降解過程：野生型α-synuclein蛋白通過CMA途徑降解，當α-synuclein過表達時，大自噬通常被誘導來彌補CMA缺陷[30]。我們課題組通過構建表達突變型α-synuclein的PC12細胞系(A53T 和A30P)，分別給于自噬誘導劑-雷帕霉素和抑制劑-渥曼青霉素，證實了在PD細胞模型中自噬水平的增高，促進自噬有助于細胞的存活[30]。予以MPP+處理野生型、A30P和A53TPC12細胞，結果顯示野生型的α-synuclein可以抑制MPP+誘導的ROS的產生，而在A30P和A53T突變的PD模型細胞中，MPP+可以明顯增加ROS的產生，這表明ROS在α-synuclein的產生和清除中發揮著重要作用[31]。

6 結語

自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現象，這種現象的出現可能是在分化過程中促使細胞進行重新組織的需要而產生的，所以自噬與細胞的生長發育過程和多種疾病的發生、發展均密切相關。目前的研究表明ROS可以作為一些疾病治療的新靶點，具有潛在的治療價值。對于因自噬體的數量及活力下降引起的與蛋白降解障礙相關的老年性疾病，如PD、AD、糖尿病和動脈粥樣硬化等，可以通過上調ROS水平從而激活自噬來降解這些蛋白達到防治疾病的目的。同時ROS對于腫瘤的研究和治療也有很大的價值，已有研究證實一些藥物可以通過引起ROS增多而上調自噬以殺傷腫瘤細胞。盡管ROS，特別是線粒體來源的，是調節自噬過程的一種信號分子，但其誘導自噬的具體機制和通路還不是很清楚，ROS誘導的自噬性細胞存活和死亡之間的關系仍待于進一步研究。

[1] Levine B, Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease[J]. Cell, 2008,132(1):27-42.

[2] 石際俊, 劉康永, 楊亞萍, 等. 自噬在帕金森病發病中的作用[J]. 生理科學進展, 2009,40(1):67-71.

[3] 楊 闖, 張宏宇， 孔曉霞,等.RNAi沉默Beclin1基因對維生素K3損傷人肝癌細胞SMMC-7721的影響[J].中國病理生理雜志，2009，25(7)：1288-1291.

[4] Fleury C,Mignotte B,Vayssiere JL. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling[J] Biochimie, 2002, 84 (2-3): 131-141.

[5] Yorimitsu T, Klionsky DJ. Eating the endoplasmic reticulum: quality control by autophagy[J]. Trends Cell Biol, 2007,17(6):279-285.

[6] Lemasters JJ, Nieminen AL, Qian T, et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy[J]. Biochim Biophys Acta, 1998,1366(1-2):177-196.

[7] Klionsky DJ, Emr SD. Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation[J]. Science, 2000,290(5497):1717-1721.

[8] Massey AC, Zhang C, Cuervo AM. Chaperone-mediated autophagy in aging and disease[J]. Curr Top Dev Biol, 2006,73:205-235.

[9] Lemasters JJ. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging[J]. Rejuvenation Res, 2005,8(1):3-5.

[10]Codogno P, Meijer AJ. Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death [J].Cell Death Differ, 2005, 12( 2 ):1509-1518.

[11]Shintani T, Klionsky DJ. Autophagy in health and disease: a double-edged sword[J].Science,2004, 306(5698): 990-995.

[12]Kiffin R, Bandyopadhyay U, Cuervo AM. Oxidative stress and autophagy[J]. Antioxid Redox Signal, 2006,8(1-2):152-162.

[13]Kaushik S, Cuervo AM. Autophagy as a cell-repair mechanism: activation of chaperone-mediated autophagy during oxidative stress[J]. Mol Aspects Med, 2006,27(5-6):444-454.

[14]Sooparb S, Price SR, Shaoguang J, et al. Suppression of chaperone-mediated autophagy in the renal cortex during acute diabetes mellitus[J]. Kidney Int, 2004,65(6):2135-2144.

[15]Kiselyov K, Jennigs JJ Jr, Rbaibi Y, et al. Autophagy, mitochondria and cell death in lysosomal storage diseases[J]. Autophagy, 2007, 3(3): 259-262.

[16]Xue L, Fletcher GC, Tolkovsky AM. Autophagy is activated by apoptotic signalling in sympathetic neurons: an alternative mechanism of death execution[J]. Mol Cell Neurosci, 1999,14(3):180-198.

[17]Kirkland RA, Adibhatla RM, Hatcher JF, et al. Loss of cardiolipin and mitochondria during programmed neuronal death: evidence of a role for lipid peroxidation and autophagy[J]. Neuroscience, 2002,115(2):587-602.

[18]Chen Y, Gibson SB. Is mitochondrial generation of reactive oxygen species a trigger for autophagy?[J]. Autophagy, 2008,4(2):246-248.

[19]Yu L, Wan F, Dutta S, et al. Autophagic programmed cell death by selective catalase degradation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006,103(13):4952-4957.

[20]Scherz-Shouval R, Shvets E, Fass E, et al. Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4[J]. EMBO J, 2007,26(7):1749-1760.

[21]Kissova I, Deffieu M, Samokhvalov V, et al. Lipid oxidation and autophagy in yeast[J]. Free Radic Biol Med, 2006,41(11):1655-1661.

[22]Reggiori F, Shintani T, Nair U, et al. Atg9 cycles between mitochondria and the pre-autophagosomal structure in yeasts[J]. Autophagy, 2005,1(2):101-109.

[23]Young AR, Chan EY, Hu XW, et al. Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes[J]. J Cell Sci, 2006,119(Pt 18):3888-3900.

[24]Kirisako T, Ichimura Y, Okada H, et al. The reversible modification regulates the membrane-binding state of Apg8/Aut7 essential for autophagy and the cytoplasm to vacuole targeting pathway[J]. J Cell Biol, 2000,151(2):263-276.

[25]Lucas AD, Greaves DR. Atherosclerosis: role of chemokines and macrophages[J]. Expert Rev Mol Med, 2001,3(25):1-18.

[26]Yuan XM, Li W, Brunk UT, et al. Lysosomal destabilization during macrophage damage induced by cholesterol oxidation products[J]. Free Radic Biol Med, 2000,28(2):208-218.

[27]童 彤, 曹勇軍, 劉春風, 等. 自噬在動脈粥樣硬化中的作用及其調控[J]. 國際腦血管病雜志, 2009,17(3):225-228.

[28]Yu WH, Kumar A, Peterhoff C, et al. Autophagic vacuoles are enriched in amyloid precursor protein-secretase activities: implications for beta-amyloid peptide over-production and localization in Alzheimer’s disease[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004,36(12):2531-2540.

[29]Ditaranto K, Tekirian TL, Yang AJ. Lysosomal membrane damage in soluble Aβ-mediated cell death in Alzheimer’s disease[J]. Neurobiol Dis, 2001,8(1):19-31.

[30]Klionsky DJ, Ohsumi Y. Vacuolar import of proteins and organelles from the cytoplasm[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 1999,15(1):1-32.

[31]Qian JJ, Cheng YB, Yang YP, et al. Differential effects of overexpression of wild-type and mutant human α-synuclein on MPP+-induced neurotoxicity in PC12 cells[J]. Neurosci Lett, 2008,435(2):142-146.

ROS-mediatedautophagyanditsroleinthepathogenesis

YOU Shou-jiang1, SHI Ji-jun1, ZHANG Yan-lin1, LIU Chun-feng1，2

(1DepartmentofNeurology,SecondAffiliatedHospital,2LaboratoryofAgingandNervousDiseases,InstituteofNeuroscience,SoochowUniversity,Suzhou215004,China.E-mail:liucf@suda.edu.cn)

Reactive oxygen species (ROS) are generally small, short-lived and highly reactive molecules, and formed by incomplete one-electron reduction of oxygen. ROS act as signaling molecules involving in a variety of intracellular processes, such as proliferation, immunity and apoptosis. The intracellular excessive accumulation of ROS may cause oxidative stress, and eventually lead to cell death and to participate in the pathogenesis of many diseases. Autophagy, a process by which eukaryotic cells degrade and recycle macromolecules and organelles, plays an important role in the cellular response to oxidative stress. Here, we review the recent reports suggesting ROS of mitochondrial origin as signaling molecules in autophagy and its role in the pathogenesis.

自吞噬作用； 活性氧； 線粒體； 自噬性細胞死亡

Autophagocytosis; Reactive oxygen species; Mitochondria; Autophagic cell death

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.037

1000-4718(2011)01-0187-04

2010-03-02

2010-07-06

國家自然科學基金資助項目(No.30870869/C090301)

△通訊作者 Tel:0512-67783307; E-mail: liucf@suda.edu.cn