產紅色素酵母菌的分離、鑒定及其基礎培養基的優化

李潔慧，單曉麗，宮春波，孫 濤

(青島農業大學食品與科學工程學院，山東青島266109)

產紅色素酵母菌的分離、鑒定及其基礎培養基的優化

李潔慧，單曉麗，宮春波*，孫 濤

(青島農業大學食品與科學工程學院，山東青島266109)

利用微生物平板分離方法，從花生渣土、椰汁土中分離、篩選得到3株產紅色素菌株。光學鑒定發現菌體呈現橢球形，大小約為(2.5～5.0)μm×(5.5～8.0)μm;無性繁殖為出芽生殖。根據菌體形態特征、群體形態特征和生理生化反應，3株菌株歸屬于紅酵母屬(Rhodotorula)，命名為紅酵母FS－1(Rhodotorula sp.FS－1)。依據OD值法、DCW法測得紅酵母FS－1的典型生長曲線為:延滯期，0～8h;對數期，8～24h;穩定期，24～34h;衰亡期為34h后。紅酵母 FS－1能夠較好地利用豆芽汁蔗糖培養基作為其發酵基礎培養基產生紅色色素。

酵母菌，紅色色素，基礎培養基

色素作為一種重要的食品添加劑，在食品行業的應用越來越廣泛，按來源通常分為合成色素、仿天然色素和天然色素［1］，天然色素因其具有高安全性、營養保健作用并能更好地呈現天然物質的顏色而越來越受到人們的關注。很多食品級安全的真菌、細菌等微生物在菌體生長過程中能產生不同顏色和結構的色素，為開發微生物源性食品著色劑提供了良好的來源。另外，微生物生長能夠克服季節、氣候等限制因素，利用發酵獲得大量目標色素，因此研發微生物源性色素日益受到重視。酵母菌是一類單細胞的食品級安全真核微生物，以其結構簡單、繁殖快速、相對于細菌更安全等優點被人們普遍接受并廣泛用于工業生產中，利用酵母菌生產天然色素在食品添加劑行業中具有極其廣泛的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腐爛花生皮土壤、花生油渣土壤 采自萊陽花生油廠;椰子汁培育土壤 青島農業大學園藝實驗地;大豆粉、豆芽汁、玉米面 市售;培養基［2－4］分離培養基:PDA固體培養基，鑒別培養基:PDA培養基、麥氏培養基、麥芽汁瓊脂培養基、無碳培養基、無氮培養基、缺維生素培養基、高滲透壓培養基、產類淀粉培養基、脲素培養基、醋酸瓊脂培養基、明膠液化培養基、碳酸鈣培養基、產酯培養基;5%孔雀石綠染液，盧哥氏碘液，結晶紫染液，番紅(沙黃)染液等其他常規試劑。

LXJ－Ⅱ型離心機、LXJ－Ⅱ離心沉淀機 上海醫用分析儀器廠;SPX型智能生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫用核子儀器有限公司;JY2002電子天平 上海精密科學儀器有限公司;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;UV－2100分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司;Anke Tall－16臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;攝像顯微鏡 BK－DM320。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物的分離方法［5］稱取土壤樣本置于無菌水中，配制成不同稀釋梯度的菌懸液，選擇合適的稀釋梯度，經平板分離初篩，挑取目標菌落轉接種斜面培養基，備用。

1.2.2 菌種的鑒定方法 參考文獻［2－6］中推薦的方法對菌株的菌落形態、細胞形態、有無假菌絲、生殖方式等形態學特征進行觀察，利用碳源發酵、同化實驗、37℃條件生長、高滲透壓培養基生長、無維生素培養基生長、醋酸生長、產類淀粉、產酸、產酯、分解脲素、明膠液化等生理生化反應進行生理生化測定，并對照《酵母菌的特征與鑒定手冊》初步鑒定目標菌株的歸屬。

1.2.3 生長曲線的測定［7］在裝有80mL豆芽汁培養基的錐形瓶中按8%的接種量接入酵母菌的菌懸液，28℃、140r/min 振蕩培養，培養后第 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、40、43、47、51、55h分別在560nm波長下以不接菌的培養液為空白對照測定其OD值。以培養時間為橫坐標、相應的吸光度為縱坐標，繪制酵母菌生長曲線。

1.2.4 生物量的測定方法［8］OD值法:依據酵母菌的生物量與發酵液的吸光度呈正相關，在波長560nm處測定其吸光度(比色杯直徑為1cm)，得OD560。

干細胞重法(DCW法):離心前將離心管放入鼓風干燥箱中烘干若干小時，自然冷卻，分析天平稱重。取5mL發酵液置于離心管中，4000r/min離心10min，棄上清，85℃烘干12h，稱重，用差量法得干細胞重。

2 結果與分析

2.1 菌體的分離、純化

從腐爛花生皮的土壤、花生油渣土和椰汁培育土壤中經平皿劃線分離法，分別得到呈粉紅色、淡黃色、橘紅色，黏稠、濕潤，表面平坦無褶皺，邊緣整齊的菌落。挑取其中3株粉紅色菌落作為篩選的目的菌株，分別編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，斜面冷藏保存備用。

2.2 菌體個體形態、群體形態觀察

將菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在PDA固體培養基上點接種，28℃，72h培養，菌落均呈橘紅色圓形菌落，菌落直徑在1.5mm左右，中央略微隆起，質地均勻，無褶皺，邊緣整齊，黏稠，隆起于培養基表面，易挑起，正反面顏色一致(圖1)。菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在麥芽汁液體培養基中培養3d后，可看到發酵液呈現橘黃色，底部有橘紅色沉淀物，靜止沉淀后得到橘紅色菌體沉淀物。

菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在光學顯微鏡1000倍下觀察，細胞呈橢圓形，大小約為(2.5～5.0)μm ×(5.5～8.0)μm，無性繁殖方式為出芽生殖(圖2);產孢培養基上獲得的菌體，簡單美藍染色，光學顯微鏡1000倍下觀察，能夠推定菌株能在產孢子培養基上產生子囊孢子(圖3);假菌絲實驗和擲孢子形成實驗表明，該菌株不產假菌絲，亦不產生擲孢子。

2.3 菌株生理生化特征及鑒定結果

圖1 菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ豆芽汁固體培養基平板菌落特征

圖2 光學顯微鏡下菌體個體形態及其出芽生殖(1000倍)

圖3 產孢子培養基上產生子囊孢子(1000倍)

參照文獻［2－4］，按照鑒定要求對菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進行發酵實驗、同化實驗、產酯實驗、產酸實驗等。實驗結果見表1，可知菌株能夠以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、半乳糖以及乙醇作為碳源，同化實驗陽性;但發酵實驗陰性;菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ可以利用硫酸銨、硝酸鉀，37℃均能夠生長，產酯不產酸。

表1 菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ生理生化鑒定結果

綜合菌體的個體形態、群體形態和生理生化鑒定結果，對照《酵母菌的特征和鑒定手冊》［2］分析，發現菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ屬于同一種酵母菌，鑒定為紅酵母屬(Rhodotorula)，初步判定為一株紅酵母(Rhodotorula sp.)，命名為紅酵母 FS－1(Rhodotorulasp.FS－1)。

2.4 菌體生長曲線的測定及其結果

根據OD值法，紅酵母FS－1生長曲線測定結果見圖4;依據干細胞重法(DCW法)，紅酵母FS－1生長曲線測定結果見圖5。圖4、圖5表明，前8h酵母菌生長曲線趨于平緩，生長緩慢，處于菌體生長的延滯期;8～24h酵母菌的OD值、DCW值曲線增長迅速，呈現對數增長，為菌體生長的對數期;24～34h后菌體生長趨于穩定，生長曲線較平緩，說明菌體生長處在穩定期;34h后OD值、DCW值均呈現下降趨勢，為菌體生長的衰亡期。在振蕩培養的過程中發現，橘紅色色素在34h后逐漸開始產生，符合微生物產次級代謝產物的一般規律［9］。DCW法測定的曲線趨勢圖與OD值法測定的曲線較吻合，相互印證了其生長規律。

圖4 紅酵母FS－1的典型生長曲線(OD值法)

圖5 紅酵母FS－1的典型生長曲線(DCW法)

2.5 發酵培養基的初步篩選結果

2.5.1 不同發酵基礎培養基對紅酵母FS－1生物量的影響 以PDA液體培養基、豆芽汁、麥芽汁培養基為發酵基礎培養基，28℃、72h培養紅酵母FS－1，測得的OD值和DCW值結果見圖6，可以看出紅酵母FS－1在3種基礎培養基中的生物量差別不大，PDA液體培養基獲得的酵母生物量較大，麥芽汁培養基次之，豆芽汁培養基較少，但差距并不顯著。然而，就色素生產而言，豆芽汁培養基中的色素鮮亮、雜質少。另外，PDA液體培養基和麥芽汁培養基中含有大量沉淀物不易去除，且影響色素顏色及其后期提取、純化。因此，綜合考慮，選擇豆芽汁培養基作為發酵基礎培養基。

2.5.2 基礎培養基不同碳源對紅酵母FS－1生長的影響 以豆芽汁培養基為發酵基礎培養基，測定葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖和甘露醇五種碳源對紅酵母FS－1生物量的影響，結果見圖7，表明將葡萄糖、半乳糖、蔗糖作為碳源時，紅酵母FS－1生長的OD值差異不顯著，而DCW值則以蔗糖為最大，并且72h時，各碳源的發酵基礎培養基均有橘紅色色素產生，由此確定蔗糖為紅酵母FS－1發酵基礎培養基的

圖6 紅酵母FS－1在3種發酵基礎培養基中的生長情況最佳碳源。

圖7 紅酵母FS－1在不同碳源發酵基礎培養基中的生長情況

3 討論

運用微生物平板劃線分離法，從腐爛花生皮土、花生油渣土以及椰汁培育土樣中共分離到3株產橘紅色色素菌株，通過菌體的個體形態特征、群體形態特征和生理生化鑒定結果，對照《Yeasts:Characterisitics and Identification》分析，確認分離到的菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ屬于紅酵母屬(Rhodotorula)，初步判定為一株紅酵母(Rhodotorula sp.)，命名為紅酵母FS－1(Rhodotorula sp.FS－1)。酵母菌的生長趨勢為0～8h為延滯期，8～24h 為對數生長期，24～34h 為穩定期，34h 后為衰亡期，這與蔡金星［10］、王秋菊［7］、陳龍泉［11］等人研究的酵母菌生長趨勢基本吻合。本研究確定紅酵母FS－1生長的最優碳源為蔗糖，這與王歲樓［12］、倉一華［13］、張琇［14］等人的研究結果一致。胡萍［15］、張卉［16］等人則發現葡萄糖為產類胡蘿卜素酵母菌發酵的最佳碳源。在諸多研究中發現，葡萄糖和蔗糖對產類胡蘿卜素酵母菌的生長影響差別不大，在工業生產中，為降低生產成本，通常選擇葡萄糖為最佳發酵碳源。

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Isolating and identifying red pigment produced starin and optimizing fermentation fountation medium

LI Jie－hui，SHAN Xiao－li，GONG Chun－bo*，SUN Tao

(College of Food Science and Engineering，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China)

Three prouduced red pigment strains were scaned by using the microorganism plate pure isolation technique from peanut dregs pollution soil，peanut oil dregs pollution soil and coconut milk pollution soil.The three isolated strains belonged to Rhodotorularby morphologicalfeature and physiology and biochemistry characteristics，it was called Rhodotorula sp.FS－1.Rhodotorula sp.FS－1 appeared to elliptocytosis，was(2.5～5.0)μm ×(5.5～8.0)μm.Rhodotorula sp.FS－1 asexual reproduction was budding.By determining turbidimetry(OD)and dry cell weight(DCW)，Rhodotorula sp.FS－1 growth curve was divided into four growth phase，respectively was lag phase 0～8h，exponential phase 8～24h，stationary phase 24～34h，death phase or decline phase behind 34h.The fermentation fountation medium of Rhodotorula sp.FS－1 for producing red pigment was bean sprouts medium with sucrose.

yeast;red pigment;fermentation fountation medium

TS201.3

A

1002－0306(2011)09－0227－04

2010－09－17 *通訊聯系人

李潔慧(1987－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:食品微生物及發酵工程。