馬尾松花粉中總黃酮類物質提取條件的研究

李雪梅，陳 輝，李書國，曹雅虹

(河北科技大學，河北石家莊050018)

馬尾松花粉中總黃酮類物質提取條件的研究

李雪梅，陳 輝，李書國，曹雅虹

(河北科技大學，河北石家莊050018)

采用溶劑浸提法從馬尾松花粉中提取總黃酮類物質。通過單因素實驗對影響馬尾松花粉黃酮類物質提取率的因素進行了研究，并通過正交實驗設計對其提取工藝進行了優化。結果表明，脫脂處理對總黃酮類物質的提取率沒有明顯影響;乙醇是馬尾松花粉總黃酮類物質的最適提取劑，其最佳提取條件為乙醇濃度95%，料液比為1∶25，溫度為70℃，在此條件下，總黃酮類物質的提取率為13.52mg/g。

總黃酮類物質，馬尾松花粉，提取

松花粉又名松黃，是馬尾松、油松或同屬樹種的雄性生殖細胞。由于松花粉源自多年生的木本植物，所以較之草本植物的花粉富集了更多的生命元素和營養成分，主要包括蛋白質、氨基酸、脂肪、糖類、有機酸、核酸、維生素、礦質元素、不飽和脂肪酸、黃酮、纖維素、多糖、激素、膽堿、酶和輔酶等，成分種類達200余種，且搭配合理。現代營養學表明，每100g松花粉中含有1.76g黃酮。黃酮類化合物具有降低心肌耗氧量、增加腦血管流量、降血糖、降血脂等作用，同時它還是一種天然的抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老、增強機體免疫力的生理活性。因此，在化妝品、保健品以及飼料添加劑等方面都有廣闊的應用前景。本實驗采用溶劑浸提法提取馬尾松花粉中的總黃酮類物質，并通過正交實驗設計對其提取工藝條件進行優化，從而為松花粉營養成分的研究和保健產品的開發提供一定的參考［1－3］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

純天然超微破壁馬尾松花粉 北京富元康靈生物科技有限公司，食用型，破壁率≥99%;蘆丁標準品 湖南中辰科技有限公司，純度98%;石油醚(沸程:30～60℃)、無水乙醇、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 北京北化福瑞化工有限公司，分析純。

VIS－7220型分光光度計 鄭州創宇科技有限公司;HH－4型數顯恒溫水浴鍋 金壇市友聯儀器研究所;TD5A－WS型臺式低速離心機 東星(廈門)電子儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品中總黃酮含量的測定方法 采用“NaNO2－Al(NO3)3－NaOH”方法結合吸光光度法測定松花粉中總黃酮的含量［4］。

1.2.1.1 標準曲線的繪制 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品10mg，置100mL容量瓶中，加95%乙醇70mL，置于超聲波清洗機中使之充分溶解，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.1mg/mL的蘆丁對照溶液。

精密吸取蘆丁對照溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于10mL容量瓶中，補充95%的乙醇至5mL，然后加入5%NaNO2溶液0.3mL，使混勻，靜置6min;加入10%Al(NO3)3溶液0.3mL，搖勻，靜置6min;加入4%NaOH溶液4.0mL，再加95%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12min，以空白樣作參比，在510nm波長處測定吸光度。以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，利用線性回歸，得出標準曲線及方程(見圖1)。

圖1 蘆丁對照品標準曲線

1.2.1.2 樣品總黃酮的提取與測定 準確稱取干燥的破壁松花粉2g，置于100mL帶有膠塞的錐形瓶中，按照一定的料液比加入浸提劑，在一定的溫度條件下提取一定時間，離心取上清，用95%乙醇定容至100mL，然后按1.2.1.1的操作測定吸光度值，并代入上述回歸方程，計算得出樣品的總黃酮含量。

總黃酮提取率(mg/g)=樣品中總黃酮的含量/樣品的質量

1.2.2 單因素實驗 以樣品總黃酮提取率為指標，對浸提劑的種類、浸提溫度、浸提劑濃度、料液比、浸提時間等影響總黃酮提取效果的因素進行研究，并考察脫脂處理對總黃酮提取效果的影響。

1.2.3 正交實驗 在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗對松花粉總黃酮類物質的提取條件進行優化。正交實驗因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同提取劑對黃酮類物質提取效果的影響

在料液比(m/v)1∶20、浸提溫度70℃、浸提時間2h的條件下，分別采用95%乙醇、乙酸乙酯和蒸餾水提取樣品中的黃酮類物質，結果如表2。

表2 不同提取劑對黃酮類物質提取效果的影響

從表2可以看出，蒸餾水的提取效果最差，乙醇作為提取劑時黃酮的提取率最高，這與黃酮在有機溶劑中有較大的溶解性有關。資料表明，黃酮類化合物的溶解度因結構及存在狀態不同而有很大差異。一般游離苷元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑及稀堿水溶液中。因此，實驗中采用乙醇作為提取劑。

2.1.2 脫脂處理對黃酮類物質提取效果的影響 首先用石油醚對松花粉進行脫脂處理，然后稱取脫脂和不脫脂松花粉各2g，用95%的乙醇，在料液比1∶20，溫度70℃條件下浸提2h，結果見表3。

表3 脫脂處理對松花粉總黃酮提取效果的影響

從表3可以看出，松花粉脫脂處理對黃酮的提取率影響不大，因而從經濟角度和操作方便性角度考慮，后續實驗均采用不脫脂的松花粉為原料。

2.1.3 提取劑濃度對黃酮類物質提取效果的影響在料液比1∶20、浸提溫度70℃、浸提時間2h條件下，用不同濃度的乙醇提取松花粉中的總黃酮類物質，結果見表4。

表4 乙醇濃度對黃酮類物質提取效果的影響

從表4可以看出，當乙醇濃度為90%時，總黃酮提取率最高，因此后續單因素實驗中采用90%乙醇作為浸提劑。

2.1.4 料液比對黃酮類物質提取效果的影響 采用90%的乙醇作為提取劑，設定料液比為 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，在溫度 70℃ 條件下浸提 2h，結果見表5。

表5 料液比對黃酮類物質提取效果的影響

從表5可以看出，隨著料液比的不斷減小，總黃酮類物質的提取率隨之升高，料液比1∶20時黃酮的提取率最高，之后，隨著料液比的繼續減小，總黃酮的提取率沒有明顯改變，考慮到成本及溶劑回收問題，因此后續實驗選擇1∶20為最適料液比。2.1.5 提取時間對黃酮類物質提取效果的影響 采用90%的乙醇作為提取劑，在料液比1∶20，浸提溫度70℃條件下，分別浸提1、1.5、2、2.5、3、3.5h，結果如表6 所示。

表6 提取時間對黃酮類物質提取效果的影響

從表6可以看出，隨著提取時間的延長，總黃酮的提取率也隨之增大，浸提2.5h時達到最大，而繼續延長提取時間，總黃酮提取率又稍有下降，這可能是由于在70℃的條件下長時間的加熱會導致黃酮類物質中部分熱敏性物質的分解或結構的改變，造成吸光度值的減小，因而提取率會有所下降。因此，選擇2.5h為最佳浸提時間。

2.1.6 提取溫度對黃酮類物質提取效果的影響 采用90%的乙醇作為提取劑，料液比為1∶20，在不同溫度條件下分別浸提時間2.5h，結果見表7。

表7 提取溫度對黃酮類物質提取效果的影響

從表7可以看出，提取溫度低于70℃時，隨溫度的升高，黃酮提取率明顯增加，溫度達70℃時，黃酮的提取率最高。但超過70℃，松花粉中黃酮類物質提取率反而隨溫度升高而降低。分析其原因，一方面可能是由于溫度過高，對黃酮類物質的穩定性有一定的影響，同時溫度過高時溶劑揮發嚴重，結果都會導致總黃酮提取率的降低。因此選擇70℃為最適宜提取溫度。

2.2 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，根據2.3中的設計方案，采用L9(34)表進行正交實驗，對馬尾松松花粉中總黃酮的提取條件進行優化，結果見表8。

表8 正交實驗結果與分析

由表8可知，在考察的三個因素中，影響松花粉中黃酮類化合物提取率的主次順序依次為:B＞A＞C，即乙醇濃度＞提取溫度＞料液比，其最佳的提取條件為A2B3C3，即提取溫度70℃、乙醇濃度為95%、料液比1∶25。根據該條件進行實驗，所得馬尾松花粉總黃酮類物質的提取率為13.52mg/g。

3 結論

3.1 松花粉中含有脂肪酸，比較脫脂與不脫脂的松花粉總黃酮類物質的提取率，結果表明提取效果上沒有明顯的差別，因而松花粉是否經過脫脂處理對黃酮的提取率影響不大，從經濟角度考慮，可采用不經脫脂處理的松花粉作為原料。

3.2 實驗采用乙醇作為提取劑，松花粉總黃酮類物質的最佳提取工藝為:乙醇濃度95%、料液比1∶25、提取溫度70℃，在此實驗條件下總黃酮的提取率為13.52mg/g。

［1］毛永強.松花粉的營養成分及保健功能綜述［J］.中國食物與營養，2008(3):50－52.

［2］李娜.松花粉營養成分及生物活性的研究進展［J］.安徽農學通報，2008，14(13):125－127.

［3］王敏.松花粉的成分及藥理作用研究發展［J］.安徽醫藥，2008，12(4):357－358.

［4］羅偉強，李濟權，黃梅珍.花生殼中總黃酮含量的測定［J］.西部糧油科技，2002，27(2):48－49.

Extraction of total flavonoids from pinus pollen

LI Xue－mei，CHEN Hui，LI Shu－guo，CAO Ya－hong

(Institute of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China)

The total flavonoids were prepared from pinus pollen by the organic solvents.The factors which influcing the extraction rate of total flavonoids were studied and optimized through single－factor and orthogonal experimental design.The results showed that fat removal treatment had no manifest influence on the extraction of the total flavonoids.The optimal extraction conditions were as follows:95%ethanol concentration，solid to liquid ratio 1∶25，temperature 70℃，time 2.5h.Under this condition，the extraction rate of total flavonoids was 13.52mg/g.

total flavonoids;pinus pollen;extraction

TS201.2

B

1002－0306(2011)08－0264－03

2010－07－29

李雪梅(1971－)，女，在讀博士，副教授，研究方向:食品生物技術與保健食品。