等離子體處理乙丙交酯共聚物表面固定膠原的研究

崔 媛,段 潛,李艷輝

(長春理工大學,長春 130022)

等離子體處理乙丙交酯共聚物表面固定膠原的研究

崔 媛,段 潛,李艷輝

(長春理工大學,長春 130022)

選擇等離子體對乙丙交酯共聚物(PL GA)表面進行活化處理來接枝膠原。通過測定等離子體處理后PL GA材料表面水接觸角確定最佳處理功率為60W,時間5min。XPS分析確定膠原表面的羧基與PL GA表面等離子體激活的羥基發生了反應生成酯基,而使膠原接枝到PL GA表面。選用小鼠胚胎內皮成纖維細胞(3T3)在PL GA材料表面培養。實驗定性觀察確定膠原接枝有利于細胞的黏附和增殖。采用四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)對不同時期兩種細胞生長情況進行定量分析,結果表明,接枝膠原的存在改善了細胞黏附作用,加快了細胞的增殖速度。

PL GA;等離子體;膠原

乙丙交酯共聚物(PL GA)是羥基乙酸和乳酸聚合而成的無功能側基的共聚物,它兼有聚乙交酯和聚丙交酯二種聚酯材料的優勢。該共聚物結構規整,組成固定,降解性能穩定。PL GA可以通過調節組成、分子量來調節其生物相容性、生物降解速度、增強材料的強度和模量,因此,PL GA已被廣泛地應用于生物醫學工程領域,如藥物緩釋體系,生物體吸收性縫合材料,內置隔離材料,骨科固定及組織修復[1-3]。但是作為組織工程材料,PL GA同時也存在的許多的缺點,PL GA中有大量的酯鍵,親水性差,降低了它與其他物質的生物相容性這會導致體內的排異反應,形成發炎、感染、本體組織壞死和血栓等,因此,實際應用中要對材料進行改性處理[4]。等離子體表面改性由于不影響材料本體特征,并能在材料表面引入大量可供反應的化學基團,因此,這種方法目前在生物材料表面改性方面得到了越來越廣泛的應用[5-7]。而在材料表面固定膠原,也是目前提高生物材料表面相容性的一個有效手段[8-10]。本研究采用等離子體處理PL GA膜材料表面,在其上面形成了具有可供反應的官能團后,在上面固定膠原,并通過一系列的表征分析手段確定膠原的接枝和細胞相容性的提高。

1 實驗

1.1 原材料

PL GA,分子量8萬,乙醚沉降提純,備用;膠原:實驗室自制[8];MTT(C18H18BrN5S):美國 AMERSCO公司;培養基(DMEM):GIBCOtm(USA);標準胎牛血清,3T3(小鼠胚胎內皮成纖維細胞):中國醫學科學院生物醫學工程研究所;氯仿、醋酸(HAc)、DMSO(二甲基亞砜):分析純,北京鼎國生物技術有限責任公司;其他試劑均為分析純。

1.2 等離子體表面處理

將純化過的 PL GA溶解在氯仿中,配成0.1%(W/V)的溶液,將玻片放入底面平整的平皿中,調成水平。將定量的PL GA溶液分別加入平皿中,緩慢蒸發溶劑,在硅化好的玻片表面干燥成膜。將表面鋪有PL GA膜的玻片放在CTP-2000k高性能等離子體輝光放電發生器腔內,按不同的等離子處理功率對材料進行輝光放電表面處理。通過測定材料表面的水接觸角,確定最佳的處理條件。

1.3 膠原在PLGA表面接枝固定及表征

表面激活的PL GA膜用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)透析過的膠溶液直接涂覆表面,4℃放置6h后在37℃放置1h,去掉表面凝膠薄層。然后用0.3%(V/V)的丙二酸浸泡30min除去未接枝的膠原,然后漂洗薄膜4～5次,PBS漂洗4～5次,三蒸水漂洗 5～6次,晾干,并在室溫測定樣品表面水接觸角(接觸角-DSA100,KRUSS公司)。

從前面的實驗結果中,選擇最好的處理條件,接枝膠原,進行 X射線光電子能譜(XPS)測試分析,未處理的PL GA膜做對照,來確定膠原是否成功地在PLGA表面接枝固定。其中 XPS(VG ESCALAB M KⅡ)采用固定通過能模式,激發源為Mg標準源 Ka線,Mg靶電壓8.0kV,靶功率240W,X射線入射角為45°,分析室氣壓保持 2.6×10-7Pa。

1.4 接枝膠原后材料細胞相容性評價

選擇3T3(小鼠胚胎內皮成纖維細胞)對接枝膠原前后的PL GA進行細胞相容性評價。將細胞種在材料表面,細胞接種密度為1×104個/mL。觀察細胞在材料表面上培養24h時的狀態,確定膠原固定是否可以促進細胞黏附和增強材料的細胞相容性。

通過MTT分析確定細胞在材料表面的生長情況,通過酶聯免疫檢測儀(Multiskan M K3,Thermo Electron Corporation)測定吸光值,反映出細胞的增殖或衰減。

2 結果與討論

2.1 PLGA等離子體處理接枝膠原前后接觸角變化

用等離子體在室溫下激活PL GA表面,處理功率為40,50,60,80W和160W,處理時間2,5,10min和20min。將測得的水接觸角平均值列于表1中。

表1 等離子體處理的PLGA表面水接觸角(°)平均值Table 1 Average value of water contact angle(°)of each different plasma treated PL GA

從表1可以看出,在一定的等離子體處理時間條件下,PL GA經過表面等離子體處理后(LP-PL GA),水接觸角有了明顯的下降,但是在低處理功率下(40,50W),PL GA表面水接觸角下降不多;隨著處理功率的增加(90W),PL GA表面水接觸角出現突降;在處理功率達到80W后,PL GA表面水接觸角達到最低,并且基本保持穩定。在大功率(>80W)處理條件下,PL GA表面水接觸角隨處理時間的變化不大;處理功率為60W時,處理時間的增加反倒不利于材料親水性的提高。親水性很強的表面不利于蛋白質的吸附,從而不利于細胞的黏附。

等離子體功率不同的時候,對材料表面造成的轟擊效果會出現差異,材料表面的粗糙程度,引入的活性基團都會受到影響,因此會出現親水性的差異。實驗數據顯示,60W的處理功率得到的幾個水接觸角數據范圍都在材料親疏水平衡范圍內,因此,本實驗選擇60W的處理功率對PL GA進行表面等離子體處理接枝膠原,理想的處理時間為5min。如果處理時間過長,材料表面被過渡刻蝕,不但影響材料的本體性能,還有可能使得材料表面的親水活性基團湮滅,親水性下降。

通過上面的實驗選擇出處理參數(60W,5min)對PL GA表面進行等離子體處理,然后接枝膠原。測定表面接枝膠原的 PL GA(COL-PL GA)的水接觸角,取10個測量點,取平均值為36.45°。可見膠原的接枝也可以提高PL GA的親水性,而且能夠保持材料表面最佳的黏附細胞的親水范圍(最佳的接觸角為20°～40°)。

2.2 PLGA表面接枝膠原前后表面XPS分析

用XPS對幾種PL GA在等離子體接枝前后樣品的表面進行表征,通過表面元素分析和C1s譜的差別確定等離子體對PL GA改性的效果,同時確定膠原是否在PL GA表面接枝。

對PLGA,LP-PLGA和COL-PLGA膜表面進行XPS測試分析,得到的元素相對摩爾分數結果列于表2。

表2 樣品表面元素相對摩爾分數Table 2 Relative mole fraction of elements of different samples

從表2可以看出,未經處理的PL GA表面氧元素含量比較高,不含氮元素;經過空氣等離子體處理后,材料表面出現少部分氮元素,同時氧元素的含量大幅度增加;而對 COL-PL GA來說,表面氧元素含量下降,氮元素含量增加。說明等離子體處理可以改變PL GA表面的元素組成,同時從氮含量增加可以判斷膠原在材料表面有效接枝。結合C1s譜分析PL GA表面改性過程中可能發生的反應。圖1給出了幾種樣品XPS C1s分峰圖。

圖1 XPS C1s分峰圖(a)PL GA膜C1s分峰;(b)LP-PL GA膜 C1s分峰;(c)COL-PL GA膜C1s分峰Fig.1 XPS C1sdivide peak chart(a)PL GA film’s C1s;(b)LP-PL GA film’s C1s;(c)COL-PL GA film’s C1s

PL GA膜的C1s譜圖可以分成3個主峰,如圖1(a)所示,分別是結合能在284.6eV的C—H和C—C峰,286.2eV的C—O(C—OH)峰和288.6 eV的O—C=O(COOH)。PL GA等離子體處理后,LP-PU表面C1s譜分成的三個主峰與PL GA類似,如圖1(b)所示。膠原接枝后,COL-PL GA膜的C1s譜可以分成4個主峰,如圖1(c)所示,分別是結合能在284.4eV的C—H和 C—C峰,285.3eV的 C—N和 O—CO—C峰,結合能在286.5eV的C—O峰和288.4eV的O—C=O。根據上面分峰的結果,計算出每個樣品表面基團相對摩爾分數,結果列于表3中。

表3 XPS C1s分峰分析結果Table 3 Fraction of carbon functional groups from high-resolution C1sXPS peaks

對圖1和表3對照分析,可以看出,PL GA材料表面的O—C=O含量較高,沒有含N官能團,見圖1(a);經過等離子體改性的PL GA材料表面含氧的官能團含量上升,其中C—OH含量上升近10%,COOH含量上升2%左右,但是沒有出現帶有端基N的官能團,見圖1(b);而前面的元素分析結果在LP-PL GA表面出現的N元素,可能由于含量有限而在C1s分峰時空氣等離子體處理 PL GA表面生產的N—C=O(結合能在287.2eV附近)被屏蔽在O—C=O峰中。

膠原接枝后,C1s譜出現了新的子峰,結合能在285.3eV的C—N和O—CO—C峰,相對摩爾分數高達30.04%,同時,C—O鍵的摩爾分數下降到17.37%。說明PL GA表面經過等離子體改性后材料表面性能發生了改變。C—O鍵的含量下降和C—N與O—CO—C＊的出現說明膠原表面的羧基與 PL GA表面等離子體激活的羥基發生了反應生成酯基,膠原通過共價接枝到PL GA表面。

2.3 膠原接枝前后3T3細胞在PLGA表面不同階段生長狀態

將3T3細胞接種在 PL GA,LP-PL GA和COLPL GA表面,培養24h后開始觀察細胞黏附和生長狀態,細胞在玻片上的狀態作為對照,如圖2所示。

從圖2(a)可以看出,PL GA表面貼壁生長的細胞剛剛進入了增殖期,細胞增殖速度比較慢,但是已經可以看到細胞的分化;LP-PL GA和玻片表面貼壁的細胞已經出現大量增殖的現象;而COL-PL GA表面貼壁的細胞增殖迅速,視野里細胞基本連接成片,部分細胞已經出現接觸抑制,細胞向長滿單層的趨勢發展。3T3細胞在長滿單層后可以向空間發展,營養足夠的話可以長成三維結構。

圖2 3T3在培養24h后在材料表面黏附和生長狀態(a)PL GA;(b)LP-PL GA;(c)COL-PL GA;(d)玻璃Fig.2 3T3 cell adhesion and living state after 24h incubation(a)PL GA;(b)LP-PL GA;(c)COL-PL GA;(d)glass

可看出,等離子體處理和膠原的接枝都有利于提高PL GA的細胞相容性,膠原接枝更為理想。通過實驗觀察,未經處理的 PL GA膜表面細胞的黏附性差,細胞在PL GA表面生長緩慢,而接枝膠原的PL GA膜表面細胞黏附能力強,細胞增殖快,因此,通過膠原接枝改性PL GA表面的細胞相容性是一個有效途徑。

經過以上定性分析可以看出,材料表面經過膠原接枝后,細胞在材料表面黏附和生長增殖好于未接枝前,且都好于玻片,說明經過膠原接枝后材料表面的細胞相容性得到了大幅度的提高。因此,通過膠原接枝改性材料表面生物性能是一個簡便而有效的途徑。

2.4 MTT實驗定量分析活細胞生長情況

為進一步確定材料表面活細胞的相對數量,引入MTT實驗進行測試分析。3T3細胞培養時間都為24h。

圖3給出了3T3細胞在PL GA類材料表面生長24h后,進行MTT分析測試,同樣經過方差計算得到MTT統計圖。空白組還是只加培養基沒加材料進行細胞培養的對照組。

從圖3可以看出,PL GA在等離子體處理后,3T3細胞在LP-PL GA表面培養24h,材料表面活細胞的數量明顯高于PL GA,說明等離子體在提高PL GA表面細胞黏附和增殖有一定的促進作用;接枝膠原后的PL GA上的活細胞數量達到最高,而且高于對照組。證明在細胞培養進入增殖期時,PL GA表面接枝膠原的存在改善細胞黏附的同時,加快了細胞的增殖速度,和前面定性分析的結果一致。

圖3 3T3活細胞在不同材料表面的數量比較Fig.3 Comparation of number of 3T3 cell living on different sample’s surface

通過以上實驗分析說明,等離子體處理接枝膠原后,PL GA的表面親水性得到了改善,其細胞相容性得到了大幅度的提高。因此,根據以上的實驗分析結果,可以建立一個模型,確立等離子體處理和膠原接枝在提高材料表面生物學性能的可行性,進而指導進一步的生物實驗乃至臨床應用。

3 結論

(1)通過等離子體表面處理,在 PL GA表面引入可供反應的羥基和羧基等活性基團。可直接在其表面固定膠原。

(2)等離子體處理最佳條件(處理功率60W,處理時間5min)用接觸角測試獲得,并用XPS分析膠原固定前后PL GA表面的變化,分析表明,這種方法可以使膠原在其表面固定。

(3)通過在材料表面培養細胞確定材料的細胞相容性。結果表明,經等離子處理并固定了膠原的PLGA,細胞在其上的生長和增殖都得到了大幅度的提高,這種方法可以提高材料的細胞相容性。

[1] SHIH C,WALDRON N,ZENTENR G M.Quantitative analysis of ester linkages in poly(dl-lactide)and poly(dl-lactide-co-glycolide)[J].Journal of Controlled Release,1996,38(1):69-73.

[2] 張宗勇,閆玉華.聚乳酸在生物醫學領域中的應用[J].生物骨科材料與臨床研究,2005,2(5):44-47.

[3] ANDO S,PUTNAM D,PACK D W,et al.PL GA microspheres containing plasmid DNA:Preservation of supercoiled DNA via cryopreparation and carbohydrate stabilization[J].Journal of Pharmaceutical Sciences,1999,88(1):126-130.

[4] THULL R.Surface functionalization of materials to initiate autobiocompatibilization in vivo[J].Materialwiss Werkst,2001,32(12):949-952.

[5] CHU P K,CHENA J Y,WANGA L P,et al.Plasma-surface modification of biomaterials[J].Materials Science and Engineering:R:Reports,2002,36(5-6):143-206.

[6] CATARINA M,YANG Y,CARNES D L,et al.Modulating bone cells response onto starch-based biomaterials by surface plasma treatment and protein adsorption[J].Biomaterials,2007,28(2):307-315.

[7] SHEN H,HU Xi-xie,FEI Y,et al.Combining oxygen plasma treatment with anchorage of cationized gelatin for enhancing cell affinity of poly(lactide-co-glycolide)[J].Biomaterials,2007,28(29):4219-4230.

[8] LI Yan-hui,HUANG Yu-dong.The study of collagen immobilization on polyurethane by oxygen plasma treatment to enhance cell adhesion and growth[J].Surface and Coatings Technology,2007,201(9-11):5124-5127.

[9] WANG Ying-jun,KE Yu,LI Ren,et al.Surface engineering of PHBV by covalent collagen immobilization to improve cell compatibility[J].Journal of Biomedical Materials Research Part A,2009,88A(3):616-627.

[10] DUAN Yuan-yuan,WANG Zhong-yi,YAN Wei,et al.Preparation of collagen-coated electrospun nanofibers by remote plasma treatment and their biological properties[J].Journal of Biomaterials Science,Polymer Edition,2007,18(9):1153-1164.

Investigation of Plasma Treatment and Collagen Immobilization on the Surface of Poly(lactid-glycolide acid)

CUI Yuan,DUAN Qian,LI Yan-hui
(Changchun University of Science and Technology,Changchun 130022,China)

For collagen is a major component of the extracellular matrix,when the surface of poly(lactid-glycolide acid)(PL GA)is grafted with collagen,cytocompatibility of PL GA will be improved.Plasma treatment is selected to immobilize collagen on the surface of PL GA.Optimum power and treating time of plasma are determined by contact angle test.The results indicate they are 60W and 5min,respectively.XPS analysis reveals that carboxy groups on collagen are reacted with actived hydroxyl groups on the surface of plasma treated PL GA to form ester groups.Then collagen is immobilized on PL GA.Cytocompatibility evaluation of collagen immobilized PL GA(COL-PL GA)was carried out by seeding 3T3 cells on the surface of COL-PL GA.Quanlitative and quantitative analysis proved that cell adhesion and proliferation are improved after collagen grafting.Quantitative result is obtained by MTT assay in cell living period.

PL GA;plasma;collagen

TQ225.24

A

1001-4381(2011)06-0058-05

國家自然科學基金資助項目(50903009);吉林省科技發展計劃項目(20100115)

2010-08-01;

2010-12-22

崔媛(1977—),女,博士研究生,助理研究員,主要研究方向為功能高分子材料合成及應用,聯系地址:長春市衛星路7089號,長春理工大學化學與環境工程學院(130022),E-mail:cuiyuan@cust.edu.cn