固定化真菌處理土霉素廢水的研究

羅 曉,王 婷

(1.河北科技大學環境科學與工程學院,河北石家莊 050018;2.河北省污染防治生物技術重點實驗室,河北石家莊 050018)

固定化真菌處理土霉素廢水的研究

羅 曉1,2,王 婷1,2

(1.河北科技大學環境科學與工程學院,河北石家莊 050018;2.河北省污染防治生物技術重點實驗室,河北石家莊 050018)

以自行分離培育的毛霉BFL-5優勢菌株為試驗菌種,采用海藻酸鹽包埋法制備固定化真菌,經活化處理后,進行處理土霉素廢水的試驗,其COD去除率可穩定在80%以上,土霉素的降解率可達95%以上。顯微鏡觀察結果說明了海藻酸鹽包埋法制備的固定化真菌屬固定化活細胞,包埋的孢子經活化后成長為菌絲體,因而降解活力顯著增大。

固定化真菌;土霉素;廢水處理;優勢菌株

固定化真菌技術在促進菌體生長和產酶方面比懸浮培養有明顯的優勢,主要是由于載體有利于營養物質的傳遞以及菌絲體的充分伸展,進而促進菌體的次生代謝,提高產酶量[1]。近年來這一技術在廢水生物處理中的應用研究與日俱增[2],但是用于處理抗生素廢水方面的研究報道較少,筆者以土霉素廢水為處理對象,研究固定化真菌的制備條件及對土霉素廢水的處理效果。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

試驗菌種為BFL-5菌株,該菌種是由河北省污染防治生物技術重點實驗室在采集腐朽樹木上生長的真菌樣品的基礎上,通過反復分離、篩選獲得的具有對廢水脫色能力強并可降解多種有機污染物的優勢菌株,經鑒定該菌株屬毛霉屬(actinom ucor elegans)。

1.2 主要試劑

氫氧化鈉、鹽酸、海藻酸鈉、氯化鈣、葡萄糖、酒石酸鈉、琥珀酸鈉、磷酸等,均為分析純;甲醇為色譜純,土霉素對照品來自中國藥品生物制品檢定所,質量分數為88.2%。

1.3 設備與儀器

試驗所用主要設備與儀器見表1。

1.4 培養基

1.4.1 固體培養基

1)制備土豆液:新鮮土豆洗凈去皮后稱取100 g,切成小塊,置于燒杯中,加入500 mL水,加熱至70℃,放置30 min,冷卻后用雙層紗布過濾取其濾液,再定容到500 m L。

2)在上述土豆汁濾液中加入10 g的葡萄糖,1.5 g的 KH2PO4,0.75 g的M gSO4,10 g的瓊脂,加熱攪拌溶解,p H值調節為4.5左右。

表1 試驗設備與儀器Tab.1 Instruments and equipments of experiment

3)上述培養基分裝于錐形瓶或試管后放入立式壓力蒸汽滅菌器,在壓力1.14 kPa下,滅菌20 min。滅菌后將錐形瓶內的培養基趁熱分裝于平皿中制備固體平板培養基。

1.4.2 液體培養基

按上述方法制備1.0 L土豆液加入燒杯中,然后依次加入0.2 g KH2PO4,0.05 g M gSO4·7H2O,0.01 g的CaCl2,10 g的葡萄糖,0.2 g的氯化銨,0.5 mL體積分數為3%的H2O2,0.28 g的酒石酸鈉,0.54 g的琥珀酸鈉,用玻璃棒攪拌使其溶解,分裝于錐形瓶中放入立式壓力蒸汽滅菌器中在壓力為1.14 kPa個滅菌20 min。

1.4.3 菌種馴化液體培養基

在1 L液體培養基加入50 mg的土霉素配制成菌種馴化液體培養基,用于菌種馴化,使其適應降解土霉素[3-5]。

1.5 菌體培養及孢子懸浮液的制備

將試管保存的菌種接種于菌種馴化液體培養基上,30℃恒溫馴化培養48 h,然后轉接到平皿固體培養基上,于30℃下培養48 h,待孢子形成后用無菌生理鹽水洗脫孢子,倒入帶有玻璃珠的三角瓶中,充分振蕩使孢子懸浮液均勻,然后在顯微鏡下用血球計數板計數測定出懸浮液孢子濃度,調節用水量可以獲得試驗所需的不同濃度的孢子懸浮液。

1.6 固定化方法[6]

取100 mL質量分數為4%的無菌海藻酸鈉溶液與100 mL孢子濃度為106個/mL的孢子懸浮液混合均勻,用注射器將混合液滴入質量分數為4%的CaCl2溶液中,形成均勻規則粒徑為3 mm的小球,靜止固化8 h后,用無菌去離子水清洗3次,即制得固定化真菌,收集備用。同時制備不含真菌的海藻酸鈣小球,做空白對比試驗。

1.7 土霉素含量的測定方法

采用高效液相色譜法來測定土霉素含量具有快速、準確、省時的特點。本試驗所用儀器為日本島津LA-10A高效液相色譜儀;SPD-M 10AVP二極管檢測器;Shimadzu ODS C18色譜柱(150 mm×6.0 mm,5μm)。測定土霉素廢水中土霉素含量時的色譜條件:流動相為0.1%(體積分數)磷酸與甲醇(其體積比為40∶60);檢測波長為254 nm;進樣量為20μL;流量為0.7 m L/min;柱溫為35℃。用此方法土霉素可得到很好地分離,出峰時間大約為4.9 min,操作簡單。在此色譜條件下進行精密度試驗,重復進樣5次,RSD值為1.12%;廢水中土霉素質量濃度為5～50μg/m L時,與峰面積大小成良好的線性關系。回歸方程為y=5×107x+102 846,R2=0.999 7。

2 結果與討論

2.1 固定化真菌的活化與顯微觀察

以孢子懸浮液為材料制備出來的固定化真菌需要經過活化處理才能具有較高的生物活性,方可用于降解廢水的試驗。活化處理的過程是將制備出來的固定化真菌小球于濾紙上吸去外表水分,量取30 m L表觀體積的固定化真菌小球放入裝有100 m L土霉素廢水的錐形瓶中,在30℃,轉速為140 rad/m in的恒溫振蕩培養箱中進行活化培養24 h,使固定化真菌小球內部的孢子萌發,菌絲充分生長。用照相顯微鏡觀察活化培養前后的固定化真菌小球切片并拍攝圖片。圖1所示為包埋物內的孢子,圖2可見固定化真菌小球內部生長著茂密的真菌菌絲(左側黑色部分)及小球表面的菌絲(右側)。觀察證明海藻酸鹽固定化真菌屬固定化活細胞,經過活化處理后真菌菌絲生長良好。

2.2 固定化真菌處理土霉素廢水的降解特性

本研究以石家莊市某制藥廠的土霉素廢水為處理對象,試驗廢水的水質為ρ(CODCr)=3 674 mg/L,土霉素的質量濃度為50.00μg/m L,p H值為5.6。在錐形瓶中加入土霉素廢水,再加入表觀體積為20%的經活化處理的固定化真菌小球,放入恒溫振蕩培養箱振蕩處理,定時取樣分析。

2.2.1 固定化真菌對土霉素廢水處理的CODCr去除規律

上述試驗廢水經固定化真菌處理后,每隔8 h取樣測定廢水CODCr的質量濃度,并計算CODCr的去除率,以分析固定化真菌對土霉素廢水處理的CODCr去除規律[7-9]。CODCr的測定結果及其去除率隨處理時間的變化見圖3。

圖3 CODCr含量變化曲線Fig.3 Change of CODCrcontent curve

由圖3可知,經固定化真菌降解后,土霉素廢水的CODCr質量濃度值顯著下降,由原水的3 674 mg/L降低到621 mg/L;去除率穩步上升,24 h時CODCr的去除率為45.4%,48 h時CODCr的去除率為74.33%,56 h時CODCr去除率達到80.23%,此后CODCr去除率維持在80%以上。

2.2.2 固定化真菌的土霉素降解特性

上述試驗廢水經固定化真菌處理后,每6 h取一次樣,測定廢水中土霉素的含量[10]。廢水中土霉素的質量濃度及其去除率的整理數據見表2。

表2 土霉素含量測定結果Tab.2 Result content of oxytetracycline

圖4 土霉素質量濃度變化曲線Fig.4 Change curve of oxytetracycline contence

土霉素質量濃度隨處理時間的變化曲線見圖4。

由圖4可知,土霉素廢水經固定化真菌處理后,廢水中土霉素質量濃度顯著下降,降解30 h時土霉素質量濃度由原水的50.00μg/m L降為 8.02μg/m L,降解率達到83.96%;36 h時土霉素含量降為 2.97 μg/mL,降解率達到94.06%,此后土霉素降解率保持穩定,維持在95%以上,表明固定化真菌能有效降解土霉素。

2.3 p H值對降解土霉素的影響

圖5 p H值對土霉素降解率的影響曲線Fig.5 Curve of influence of p H to oxytetracycline decrease rate

廢水p H值影響生物的活性,因而也影響降解土霉素的效果。試驗設計一系列不同的p H值來找出降解土霉素的最佳p H值。將土霉素廢水的p H值調至4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0。控制其他條件不變,處理36 h后取樣過濾,測定剩余質量濃度,計算土霉素降解率。結果表明p H值在4.5～5.0降解率最大,達94.06%。在p H值為4.0和7.0時,降解率分別為90.50%和87.46%。但總體上p H值的變化沒有引起降解率的強烈波動,而在生產實際中廢水的p H值經常會有變動,在一定范圍內p H值對降解土霉素的影響較小,有利于實際應用。土霉素降解率隨p H值變化曲線見圖5。

3 結 論

1)本研究采用海藻酸鹽包埋法制備固定化真菌的最佳包埋條件:包埋劑海藻酸鈉的質量分數為4%、固化劑CaCl2的質量分數為4%、交聯時間為18 h、懸液孢子濃度約為5.0×105個/m L;制備的固定化真菌經活化后具有良好的降解性能。

2)以照相顯微鏡觀察活化培養前后的固定化真菌小球切片,觀察證明海藻酸鹽固定化真菌經過活化處理后小球內部孢子發育為真菌菌絲,固定化真菌屬固定化活細胞。

3)以固定化真菌BFL-5菌株處理土霉素廢水,對土霉素的降解率可達95%以上,CODCr去除率可以達到80%。

4)以固定化真菌BFL-5菌株處理土霉素廢水,其降解土霉素最佳的p H值在4.5～5.0。

[1] 曾永剛,高大文.白腐真菌固定化技術及其影響因素的研究進展[J].哈爾濱工業大學學報(Journal of Harbin Institute of Technology),2008,40(1):141-146.

[2] 林 剛,文湘華,錢 易.應用白腐真菌技術處理難降解有機物的研究進展[J].環境污染治理技術與設備(Techniques and Equipment for Enviro Poll Cont),2001,2(4):1-8.

[3] 沈耀良,黃 勇,趙 丹,等.固定化微生物污水處理技術[M].北京:化學工業出版社,2002.

[4] 謝東海,韓 奇,唐文浩.微生物固定化技術在污水處理中的應用[J].環境與可持續發展(Environmental and Sustainable Development),2006(4):48-50.

[5] 劉寶友,羅湘南,刑質賢,等.微生物降解含煤油廢水的研究[J].河北科技大學學報(Journal of Hebei University of Science and Technology),2007,28(4):314-316.

[6] 龐勝華,劉德明.固定化微生物處理抗生素廢水[J].江蘇環境科技(Jiangsu Environmental Science and Technology),2006,19(1):14-16.

[7] 吳軍見,朱延美,王 棟,等.固定化細胞技術在廢水治理中的應用及降解動力學研究進展[J].遼寧化工(Liaoning Chemical Industry),2002,31(1):20-25.

[8] 吳 莎.光合細菌處理VB12廢水降解動力學研究[J].河北科技大學學報(Journalof Hebei University of Science and Technology),2008,29(2):242-245.

[9] 吳 莎.光合細菌-膜生物反應器處理VB12廢水的研究[J].河北科技大學學報(Journal of Hebei University of Science and Technology),2008,29(1):23-26.

[10] 劉 瑛,陳運峰.高效液相色譜法測定土霉素片的含量[J].中國藥事(Chinese Pharmaceutical Affairs),2004,18(5):300-301.

Treatment of oxytetracycline wastewater by immobilized fungus

LUO Xiao1,2,WANG Ting1,2

(1.College of Environmental Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang Hebei 050018,China;2.Hebei Key Laboratory of Biological Technique fo r Pollution Control,Shijiazhuang Hebei 050018,China)

One dominant strain of M ucor BFL-5 was separated and cultivated,and used as test organism.A lginate embedding method was used to immobilize fungi,w hich was activated before Terramycin wastewater treatment test.The COD removal rate ismore than 80%,and oxytetracycline degradation rate is up to 95%.M icroscopic observation results show the fungi embedded in alginate are immobilized living cells.Embedded spo res grow into mycelia by activating,thus their oxytetracycline degradation ability is significantly increased.

immobilized fungi;oxytetracycline;wastewater treatment;dominant strain

X703

A

1008-1542(2011)01-0098-05

2010-07-03;責任編輯:王海云

羅 曉(1973-),男,廣東崖縣人,副教授,博士,主要從事廢水生化處理方面的研究。