響應面法優化塊菌多糖提取工藝條件的研究

張世奇，闞建全，*

(1.西南大學食品科學學院，重慶400715; 2.重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶400715)

響應面法優化塊菌多糖提取工藝條件的研究

張世奇1，2，闞建全1，2，*

(1.西南大學食品科學學院，重慶400715; 2.重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶400715)

為確定塊菌多糖超聲中性水提取的最佳工藝條件，以塊菌多糖提取率為考察指標，在單因素實驗的基礎上，采用響應面法對主要提取工藝參數進行了優化，并得到了回歸模型。研究結果表明:塊菌多糖超聲中性水提取的最優工藝條件參數為超聲功率為105W，提取時間為40min，料液比為1∶25，提取溫度為75℃。在此條件下，塊菌多糖的提取率達到3.48%。實驗證明模型擬合程度良好，誤差較小，模型的選擇合適。

塊菌，多糖，響應面法，超聲提取工藝條件

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

塊菌(Truffle) 產自四川省會東縣，真空包裝，凍藏備用;無水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、硫酸 成都市科龍化工廠，分析純。

FZ102型微型植物試樣粉碎機 北京市光明醫療儀器廠;KUBOTA3740型冷凍離心機 KUBOTA Corporation;RE52-98型旋轉蒸發儀 亞榮生化儀器廠;超聲萃取裝置KQ3200DB 江蘇昆山市超聲儀器有限公司;UV-2000紫外分光光度計 上海尼柯儀器有限公司;HH-W420數顯三用恒溫水箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 塊菌多糖制備的基本工藝流程［5-6］塊菌原料→破碎(過100目)→70%(150W)超聲浸提→離心分離(4500r/min，15min)→減壓濃縮→乙醇沉淀→離心分離(4500r/min，15min)→溶劑干燥→粗多糖

1.2.2 單因素影響實驗［8］以中性水為提取劑，采用超聲處理，選用影響提取率的4個因素，即超聲時間、料液比、超聲功率(其工作頻率為40kHz，超聲電功率為150W)、提取溫度。按照1.2.1的制備方法提取塊菌多糖，并計算提取率。

1.2.3 響應曲面法實驗設計 綜合單因素影響的實驗結果，采用Box-Behnken實驗設計方案選取超聲功率(W)、超聲時間(min)、料液比(mL/g)、提取溫度(℃)4個影響因素，采用四因素三水平的響應面分析方法，分別用X1、X2、X3、X4來表示，并以+1、0、-1分別代表變量的水平，按方程xi=(Xi-X0)/ΔX對自變量進行編碼。其中xi為變量的編碼值。Xi為變量的真實值，ΔX為變量的變化步長，塊菌多糖的提取率Y為響應值(表1)。

表1 響應面分析因素與水平

1.2.4 塊菌多糖的提取率測定 粗多糖量的測定方法:苯酚-硫酸法［9］。以吸光值為縱坐標，葡萄糖溶液濃度為橫坐標，繪制工作曲線(圖1)，并求得標準曲線回歸方程，其相關系數R2=0.9994，表明在所實驗的0.1～1.0mg/100mL濃度范圍內呈良好的線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線

精密吸取多糖溶液1mL置于10mL的干燥比色管中，加入5%的苯酚1mL，混勻，再勻速滴加5mL濃硫酸，即刻搖勻。于沸水浴中加熱5min，冷卻至室溫后，在490nm處比色測吸光值。

粗多糖的提取率(%)=粗多糖的量/原料質量×100%

2 結果與分析

2.1 單因素對塊菌多糖提取率的影響

2.1.1 超聲功率對塊菌多糖提取率的影響 采用中性純水，料液比為1∶10，超聲時間為30min，提取溫度為60℃。考察超聲功率對多糖提取率的影響(圖2)。由圖2可知，塊菌多糖的提取率在超聲功率較低時隨著超聲功率的上升而增加，在超聲功率為105W時達到最大值，之后隨著超聲功率的增加，提取率下降，并在超聲功率為135W的時候，下降趨勢變緩。

圖2 超聲功率對塊菌多糖提取率的影響

2.1.2 超聲時間對塊菌多糖提取率的影響 采用中性純水，料液比為1∶10，超聲功率為105W，提取溫度為60℃。考察超聲時間對塊菌多糖提取率的影響(圖3)。

圖3 超聲時間對塊菌多糖提取率的影響

由圖3可知，塊菌多糖的提取率隨著超聲時間的增加而呈現出先升高后降低的趨勢，這是由于隨著超聲時間的延長，細胞的破碎度越來越大，多糖就更加容易溶出。而當超聲時間超過40min時，細胞內的大量的不溶物質和粘液質等混入提取液中，使溶液中的雜質增多，粘度變稠，從而影響了多糖的溶出。另外時間過長，會造成多糖的分解，也是后期多糖提取率下降的原因［10-11］。

2.1.3 料液比對塊菌多糖提取率的影響 采用中性純水，超聲時間為40min，超聲功率為105W，提取溫度為60℃。考察料液比對塊菌多糖提取率的影響(圖4)。

圖4 料液比對塊菌多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比的增大，塊菌多糖的溶出呈逐漸上升的趨勢，在1∶25時達到最大值，而后慢慢趨于穩定。這是由于料液比較少時，不利于多糖的溶出。

2.1.4 提取溫度對提取率的影響 采用中性純水，超聲時間為40min，超聲功率為105W，料液比為1∶25。考察提取溫度對塊菌多糖提取率的影響(圖5)。

由圖5可知，隨著提取溫度的上升，塊菌多糖的提取率開始是緩慢上升，直至溫度達到65～75℃時，提取率迅速上升，而后又逐漸變緩甚至慢慢下降。這主要是由于溫度從室溫上升到65℃時，塊菌多糖在提取劑中的溶解度基本保持不變，所以在料液比一定的情況下，提取率沒有變化。但當溫度達到80℃的時候，提取率有所下降，這可能是高溫下部分多糖被水解的結果。

表3 二次響應模型方差分析

圖5 提取溫度對提取率的影響

2.2 響應面結果與分析

2.2.1 實驗結果 實驗采用Box-Behnken設計［12-15］，用自變量X1、X2、X3、X4來表示超聲功率(W)、超聲時間(min)、料液比(g/mL)、提取溫度(℃)4個影響因素。以塊菌多糖的提取率為響應值(Y)，其設計表與結果見表2。

利用Design Expert 7.0軟件對實驗結果進行響應面分析，得出回歸模型參數方差分析見表3。

由方差分析可知，模型的P值顯著。失擬項P= 1.26(＞0.05)，差異不顯著，未知因素對實驗結果干擾小，說明殘差均由隨機誤差引起。R2=0.993，說明模型擬合程度良好，實驗誤差小，該模型能夠反映響應值的變化。其二次方程為:

對表3的結果作響應面分析，見圖6～圖11，其中各圖表示X1、X2、X3、X4中任意兩個變量取零水平時，其余兩個變量對多糖提取率的交互影響。

表2 響應面分析方案及實驗結果

從圖8可以看出，在一定的范圍內，塊菌多糖的提取率隨著超聲功率和提取溫度的增加而升高，兩者交互作用為極顯著。由圖10同樣可以看出，塊菌多糖的提取率也隨著超聲時間和提取溫度的增加而逐漸提高，兩者交互為極顯著。根據動力學原理，超聲溫度的升高，使得多糖分子的運動加劇，時間的延長有利于多糖的充分擴散析出，隨著超聲功率的升高，使得多糖分子解附和擴散的運動速率不斷加快，從而使提取率升高。由圖9看出，隨著超聲時間和料液比的不斷升高，多糖的提取率也隨之逐漸提高，兩者交互為顯著。從圖6、圖7、圖11可得其它幾種交互作用對多糖的提取率影響較小，兩者交互作用均為不顯著。

圖6 超聲功率與提取時間及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應面

圖7 超聲功率與料液比及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應面

圖8 超聲功率與溫度及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應面

圖9 超聲時間與料液比及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應面

圖10 超聲時間與溫度及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應面

圖11 溫度與料液比及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應面

2.2.2 驗證實驗 利用Design Expert 7.0軟件進行工藝參數的優化組合［16］，所得產品提取率最大值對應的相關參數、預測值、驗證結果見表4。

表4 優化工藝驗證結果

在優化條件(超聲功率105W，超聲時間40min，料液比1∶25，提取溫度75℃)下對此優化結果進行驗證，實際測定塊菌多糖提取率為3.48%，與預測值基本一致(相對誤差)，再次驗證了回歸方程的正確性。

3 結論

采用超聲中性水浸提法提取塊菌多糖，其優化的工藝參數為:超聲功率104.7W，超聲時間40.4min，料液比1∶24.65，提取溫度75.05℃。依據現有實驗條件經過微調，其最佳的工藝參數為:超聲功率105W，超聲時間40min，料液比1∶25，提取溫度75℃。通過3批次的驗證實驗，其多糖提取率平均3.48%，與預測值接近，證明了本實驗設計與分析方法較準確可靠。

［1］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海:上海科學技術出版社，1978:274-277.

［2］陳惠群，劉洪玉，楊雪梅，等.塊菌生態和生理特性研究［J］.資源開發與市場，1999，15(1):11-15.

［3］陳應龍.黑孢塊菌的菌根合成及其超微結構研究［J］.中國食用菌，2002，21(5):15-17.

［4］胡慧娟，李佩珍，林濤，等.塊菌多糖對小鼠腫瘤及免疫系統的影響［J］.中國藥科大學學報，1994，25(5):289-292.

［5］胡炳福.塊菌研究及我省開發利用塊菌資源前景展望［J］.貴州林業科技，2003，31(1):10-16.

［6］梁敏.香菇多糖的功能性與提取方法探討［J］.食品研究與開發，2008，29(12):175-177.

［7］謝紅旗，周春山，杜邵龍.酶法提取香菇多糖新工藝研究［J］.食用菌，2006，28(4):59-61.

［8］胡斌杰，王芳，王方林.超聲法提取香菇多糖最佳工藝優化研究［J］.中成藥，2007(7):4-6.

［9］Dubois M，Gilles KA，Hamilton JK，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Anal Chem，1956，28:350.

［10］黃森，查學強，羅建平，等.Box-Behnken法優化提取霍山石斛活性多糖的研究［J］.中藥材，2007，30(5):591-594.

［11］念保義，王錚敏，黃河寧.超聲提取、超濾分離香菇多糖工藝的研究［J］.化學與生物工程，2004，21(4):16-18.

［12］吳瓊，鄭成，寧正祥，等.堿溶性銀耳粗多糖的提取及其清除自由基作用的研究［J］.食品科學，2007，28(6):153-155.

［13］劉貝貝，李小定，潭正林，等.菜籽餅粕中多糖的酸提取工藝優化［J］.農業工程學報，2006，22(11):213-216.

［14］劉洋，趙謀明，楊寧.響應面分析法優化仙人掌多糖提取工藝的研究［J］.食品與機械，2006，22(6):42-45.

［15］劉軍海，黃寶旭，蔣德超.響應面分析法優化艾葉多糖提取工藝研究［J］.食品科學，2009，30(2):114-118.

［16］吳有煒.實驗設計與數據處理［M］.蘇州:蘇州大學出版社，2002:115-154.

Optimization of extraction technique of polysaccharides from truffles via response surface methodology(RSM)

ZHANG Shi-qi1，2，KAN Jian-quan1，2，*
(1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China; 2.Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage，Chongqing 400715，China)

Optimal processing parameters for ultrasonic-assisted extraction of truffle polysaccharide in neutral water medium were determined.On the basis of single factor experiments and according to Box-Behnken test design principles，the method of response surface method(RSM)for optimal parameters was adopted.Finally，the optimal extraction process was obtained as follows:ultrasonic power 105W，ultrasonic processing time 40min，ratio of liquid to sample 25∶1，extraction temperature 75℃.Under these conditions，the yield of polysaccharide truffles reached 3.48%.The model turned out to be with good fitting degree and minor error.

truffles;polysaccharide;response surface methodology;ultrasonic extraction conditions

TS201.2

B

1002-0306(2011)11-0345-05

塊菌(Perigord Truffle)又稱塊菇、松露、無娘藤、豬拱菌［1］等，屬于子囊菌亞門、塊菌目、塊菌科、塊菌屬［2-3］，是地下菌(Hypogeous fungi)中的一個比較重要的子囊菌類群。子實體在土壤中生長，除個別種類在成熟時半露出土表外，大部分種類自始至終埋生于地下，是與樹木共生的外生菌根型藥食兩用真菌。塊菌的主要活性成分有α-雄烷醇、神經酰胺、塊菌多糖(polysaccharide of Tuber sinense，PST)等。研究表明，塊菌多糖作為一種新的真菌多糖，水溶性好、毒性低、抑制腫瘤作用明顯，可望開發成抗腫瘤免疫療法的藥物［4-5］。現有的提取多糖的方法主要為堿提取法、酸提取法和中性水提取法［6-7］，通過實驗驗證，酸法提取塊菌多糖效果不明顯且在酸性的條件下糖苷鍵容易被破壞，堿法提取后用90%的乙醇醇沉時多糖的凝沉效果不好且提取率相比熱水浸提沒有很明顯的提高。因此，考慮到后期實驗的純化工作，本實驗采用超聲中性水浸提法。

2010-11-12 *通訊聯系人

張世奇(1983-)，男，碩士研究生，研究方向:食品質量與安全控制。