5-脂氧合酶基因沉默后裸鼠胰腺癌移植瘤相關基因的變化

張海峰 秦金丹 周國雄 丁曉凌 黃介飛

5-脂氧合酶基因沉默后裸鼠胰腺癌移植瘤相關基因的變化

張海峰 秦金丹 周國雄 丁曉凌 黃介飛

目前認為，5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)代謝途徑異常是促進多種腫瘤發生、發展的重要原因之一。其機制為促進細胞過度增殖、抑制凋亡；促進惡性腫瘤血管生成；提高惡性腫瘤發生及轉移的潛能、增加腫瘤細胞的侵襲力；抑制5-LOX能使多種惡性腫瘤細胞增殖減低并誘導細胞凋亡[1]。

本實驗利用基因芯片檢測靶向5-LOX的shRNA真核表達載體導入SW1990細胞形成的裸鼠皮下移植瘤內并聯合雷公藤內酯醇(TL)治療后移植瘤組織基因表達譜的變化，探討沉默5-LOX基因表達治療胰腺癌的應用價值。

一、材料與方法

1．裸鼠移植瘤模型制作及分組：取對數生長期SW1990細胞，調整濃度為1×108個/ml，分裝于1 ml的無菌EP管中備用。18只BALB/cnu/nu裸鼠購自解放軍南京軍區醫學動物實驗中心，在SPF級屏障環境內飼養。取0.1 ml混勻的細胞懸液，注入每只裸鼠右側腋下。待移植瘤長至100 mm3左右(約10 d)按數字表法隨機分為靶向5-LOX的shRNA組、shRNA+TL組和對照組，每組6只。shRNA質粒表達載體pGPU6/GFP/Neo-ALOX5-1021由上海吉瑪公司構建，正義鏈5′-CACCGCTCCCATCTGCTTGCTGTATTTCAAGAGAATACAGCA-AGCAGATGGGAGCTTTTTTG-3′；反義鏈5′-GATCCAAAA-AAGCTCCCATCTGCTTGCTGTATTCTCTTGAAATACAGCAAG-CAGATGGGAGC-3′。shRNA瘤內注射量為50 μg/只(0.1 ml)，3 d一次，共7次；TL腹腔內注射劑量為0.25 mg/kg體重(0.2 ml)，每天一次，共19 d。第30天處死動物，取腫瘤組織，稱瘤重。取部分瘤組織，置-80℃冰箱保存。

2．移植瘤基因表達譜的檢測：采用Trizol試劑抽提移植瘤組織總RNA，采用 Cy5熒光標記，應用基因表達譜寡核苷酸芯片(31118個基因，上海生物芯片公司)進行雜交，雜交條件：50℃ 16 h后 42℃洗片。芯片結果應用 Agilent掃描儀掃描，采用 Genespring行 Normalize分析，處理組/對照組比值≥2為上調基因，≤0.5為下調基因。

3．RT-PCR驗證血管內皮生長因子(VEGF)的表達：采用RT-PCR方法檢測。VEGF引物序列：上游5′-GGGCCT-CCGAAACCATGAACTT-3′，下游5′-TCGCATCAGGGGCAC-ACAG-3′， 擴增片段260 bp；內參β-actin引物序列：上游5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′，下游5′-ATGCATTCACCT-CCCCTGTG-3′擴增片段486 bp。引物由上海invitrogen公司合成。PCR反應條件：94℃ 5 min， 94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 40 s，30次循環，72℃延伸7 min。

二、結果

1．一般情況：注射SW1990細胞懸液后裸鼠生長狀況良好，飲食以及活動正常，未出現驚恐、不安、拒食等情況。各組裸鼠治療前后的體重的改變無明顯差異(表1)。

2．裸鼠腫瘤生長情況：治療組腫瘤的生長速度減慢，移植瘤體積均小于同時點的對照組。第30天對照組平均瘤體積是用藥前的7.01倍；shRNA組是用藥前的3.11倍；shRNA+TL組是用藥前的1.97倍(圖1)。兩治療組的瘤重均較對照組顯著降低(P<0.05)，抑瘤率均達50%以上，但兩治療組間無顯著差異(表1)。

圖1注射SW1990細胞4周時shRNA+TL組(a)、shRNA組(b)和對照組(c)裸鼠的移植瘤生長情況

表1 各組裸鼠體重、移植瘤重及抑瘤率

注：與對照組比較，aP<0.05

3．差異表達基因：shRNA組上調基因401條，下調基因751條；shRNA +TL組上調基因760條，下調基因1254條。兩組共同下調的基因主要包括G蛋白耦聯受體基因、代謝相關基因、細胞周期相關基因、細胞黏附相關基因及生長因子基因等，其中有VEGF、成纖維細胞生長因子、肝細胞核因子、脂氧合酶同源性序列、表皮生長因子、NFkB 活化蛋白、血小板衍生生長因子、內皮細胞生長因子、轉錄激活因子等(圖2)。經RT-PCR驗證，兩治療組VEGF mRNA表達較對照組明顯減弱(圖3)。

圖3 各組移植瘤組織VEGF表達(RT-PCR)

討論眾多研究證實，胰腺癌組織中5-LOX mRNA及蛋白表達明顯增高，而正常胰腺組織中未見表達。抑制5-LOX的表達可導致胰腺癌細胞增殖抑制、凋亡增加[2-3]。我們先前的研究表明，5-LOX抑制劑齊留通、雷公藤內酯醇等處理胰腺癌SW 1990細胞后，細胞5-LOX mRNA和蛋白表達均明顯下降，凋亡增加；同時VEGF表達下調；應用靶向5-LOX的shRNA質粒表達載體同樣可有效阻斷SW1990細胞5-LOX基因表達，抑制細胞增殖及誘導其凋亡[4-8]。本實驗應用靶向5-LOX的shRNA載體瘤內注射加或不加雷公藤內酯醇注射制劑腹腔內注射的方法治療裸鼠皮下移植瘤，兩治療組的抑瘤率均超過50%，但兩種治療方法的療效無顯著差異，無聯合治療的必要。通過基因芯片檢測，兩組共同下調的基因主要包括G蛋白結合受體基因、代謝相關基因、細胞周期相關基因、細胞黏附相關基因及生長因子基因等，提示5-LOX代謝通路可以通過多條途徑影響生長因子基因的表達從而影響腫瘤細胞的增殖、分化，抑制腫瘤的生長、轉移。

[1] 李勇，李建英，王小眾.5-脂氧合酶促癌機制研究進展.世界華人消化雜志，2006，14：800-804.

[2] Hennig R,Grippo P,Ding XZ, et al. 5-Lipoxygenase, a marker for early pancreatic intraepithelial neoplastic lesions. Cancer Res,2005,65:6011-6016.

[3] 吳深寶，周國雄，張弘，等.胰腺癌細胞中5-脂氧合酶mRNA和蛋白的表達.胰腺病學,2005,4:238-239.

[4] 周國雄，吳深寶，黃介飛，等.5-脂氧合酶特異性抑制劑對胰腺癌細胞增殖和凋亡的影響.中華消化雜志,2005,25:689-691.

[5] Zhou GX， Ding XL， Huang JF， et al． Suppression of 5-lipoxygenase gene is involved in triptolide-induced apoptosis in pancreatic tumor cell lines．Biochim Biophys Acta,2007,1770:1021-1027.

[6] 張海峰，周國雄，丁曉凌，等.抑制5-脂氧合酶表達對胰腺癌細胞增殖和凋亡的影響.中華胰腺病雜志,2009,2:27-30.

[7] Ye YN,Shin VY,Cho CH,et al.Contributory role of 5-lipoxygenase and its association with angiogenesis in the promotion of inflammation2associated colonic tumorigenesis bycigarette smoking.Toxicology,2004,15:179-188.

[8] Romano M,Catalano A,Nutini M,et al.5-lipoxygenase regulates malignant mesothelial cell survival:involvement of vascular endothelial growth factor.FASEB J,2001,15:2326-2336.

2010-10-15)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.023

江蘇省重點醫學人才項目(RC2007085)；江蘇省衛生廳重大課題(K200602)

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周國雄，Email:zhouguoxiong@medmail.com.cn