急性心肌梗死患者抗心肌肌球蛋白重鏈抗體誘導心肌細胞凋亡*

邵 靚， 劉 坤， 汪 莉， 丁艷萍， 廖玉華， 王朝暉

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院心內科,湖北 武漢 430022)

·論著·

急性心肌梗死患者抗心肌肌球蛋白重鏈抗體誘導心肌細胞凋亡*

邵 靚， 劉 坤， 汪 莉， 丁艷萍， 廖玉華， 王朝暉△

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院心內科,湖北 武漢 430022)

目的探討抗心肌肌球蛋白重鏈抗體(AMHCA)誘導心肌細胞凋亡的作用及其機制。方法從急性心肌梗死患者血清中提取AMHCA，研究其對成年大鼠心肌細胞凋亡的影響。DNA末端標記膜聯蛋白-V/PI復染色法觀察和測量心肌細胞凋亡。分別用免疫印跡、膜片鉗和激光共聚焦法檢測凋亡相關蛋白P53和Bcl-2以及第二信使鈣離子的表達和濃度。結果AMHCA誘導的心肌細胞凋亡具有劑量依賴性。在此過程中，促凋亡的核蛋白P53促進心肌細胞凋亡，而抑凋亡的胞質蛋白Bcl-2 抑制心肌細胞凋亡。同時，胞內鈣離子濃度升高，而L型鈣通道則沒有影響。結論急性心肌梗死患者體內的AMHCA可能是一種新的起動因子，可誘導心肌細胞凋亡。

心肌梗死; 心肌球蛋白重鏈; 細胞凋亡; 蛋白質P53; 蛋白質Bcl-2; 鈣

急性心肌梗死是危害人類健康的重要疾病，也是導致心力衰竭的主要因素[1,2]。由急性心肌梗死向心衰的演變的過程中，神經體液因子發揮著重要的作用。血管緊張素Ⅱ、醛固酮、腎上腺素和去甲腎上腺素能夠誘發心肌細胞肥大和凋亡，而這種不可逆的改變則是導致心力衰竭中心室重塑的重要原因[3]。在過去的十數年里，越來越多的證據表明炎癥和免疫反應在心室重塑的過程中扮演著重要的角色。一些致炎細胞因子對心肌細胞產生各種病理學作用。例如，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)能直接誘導心肌細胞凋亡[4]。

促凋亡基因或抑凋亡基因在心肌中的優勢表達決定了心肌細胞凋亡的發生和發展。心肌細胞的凋亡也和細胞內鈣離子濃度的增加密切相關。鈣離子是一種與促凋亡基因和抑凋亡基因有關聯的重要的第二信使，它們共同構成了細胞凋亡的信號途徑[5]。

臨床和實驗研究表明，擴張型心肌病中心肌細胞自身抗體能對心功能和心臟結構產生損害[6]。既往的研究顯示，抗β1腎上腺素能受體、抗ADP/ATP 載體抗體和抗心肌肌球蛋白重鏈抗體(anti-cardiac myosin heavy chain antibodies, AMHCA)能夠促使心肌細胞內的鈣離子超負荷[7]。我們和其他的研究者先后報道了針對心肌肌球蛋白的自身抗體在急性心肌梗死的患者中具有較高的檢出率[8]。我們又進一步發現急性心肌梗死患者中AMHCA陽性患者的動脈瘤發生率和病死率較高。因此，心肌肌球蛋白重鏈抗體可能與急性心肌梗死的發病機制有關，而AMHCA可能在此過程中起到了重要作用。但AMHCA在急性心肌梗死時心肌細胞凋亡的過程中僅僅是一旁觀者，還是發揮病理效應仍需進一步闡明。

本實驗擬驗證從急性心肌梗死患者血清中提取的AMHCA能否誘導心肌細胞凋亡，并研究凋亡相關的信號分子包括細胞核蛋白53(protein 53，P53)和胞漿蛋白B細胞瘤基因2(B-cell lymphoma gene 2，Bcl-2)的表達以及L-型鈣離子通道和胞內鈣離子濃度的改變。

材 料 和 方 法

1病例、抗體檢測和純化

根據2008年ACC/AHA急性心肌梗死診斷標準，采集40例患者診斷為急性心肌梗死。其中男25例，女15例，平均年齡(60±10)歲。經酶聯免疫吸附法檢測AMHCA，測定特定的抗原肽序列，如下：Glu-Ile-Glu-Arg-Lys-Leu-Ala-Glu-Lys-Asp;Val-Asp-Lys-Leu-Gln-Leu-Lys-Val;Ala-Lys-Ser-Arg-Asp-Ile-Gly-Ala-Lys-Gly-Leu-Asn-Glu。40例患者外周血中AMHCA為陽性。實驗方案符合1963年《赫爾辛基宣言》所申明的原則和條款(1983年于威尼斯修改)。AMHCA陽性的血清(約10 mL全血)經親和層析的方法提純后備用(純度約為98.8%)。

AMHCA的特異性經酶聯免疫吸附法檢測，并已為為其他研究的者所證實[9]。而AMHCA的純度是經親和層析的方法提純所得，此方法是目前普遍采用的方法。

2成年大鼠心肌細胞的分離和實驗分組

2.1試劑 (1)臺氏液(mmo/L):NaCl 135, KCl 5.4, MgCl21.0, NaH2PO40.33, CaCl21.8, Hepes 10, 葡萄糖 10(NaOH調 pH 7.4)；(2)無鈣液(mmo/L): 臺氏液去掉CaCl2；(3)KB液(mmo/L): MgCl25, KCl 40, KH2PO420,牛磺酸20, 谷氨酸50, EGTA 0.5, Hepes 10, 葡萄糖 10(KOH調 pH 7.4)。

2.2方法 于無菌條件下，酶解法分離250-300 g成年大鼠心肌細胞。實驗大鼠均依照美國國立衛生研究所頒布的《實驗動物飼養和使用指南》(NIH publication No. 23-85, 1996年修改)受到良好對待。快速游離大鼠心臟置于4 ℃臺氏液中，稍作修飾后主動脈逆行插管, 通過Langendorff 37 ℃恒溫灌流裝置逆行灌流心臟。即先用無鈣液沖洗5 min,再用含有0.2 g/L Ⅱ型膠原酶(Worthington), 0.02 g/L蛋白酶E(Sigma), 0.2 g/L牛血清白蛋白(BSA) (Sigma)的酶液循環灌流5 min, 最后用KB液沖洗3 min, 剪碎心室肌, 放入KB液溫孵, 反復傾出上清液, 靜置1 h備用。將新鮮分離的心肌細胞置含有10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養基中于37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養24 h。加入不同濃度的AMHCA，觀察其對心肌細胞凋亡的影響。未加AMHCA的心肌細胞作為對照組。

3抗體結合實驗

通過免疫印跡法檢測AMHCA與心肌肌球重鏈蛋白的結合。作為Ⅰ抗的AMHCA稀釋度為1∶10 000，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗人IgG作為Ⅱ抗，稀釋度1∶7 500。通過免疫熒光法觀察AMHCA與心肌細胞的結合。將新鮮分離的大鼠心肌細胞凃片后常規固定、封閉。繼而將涂片與1∶100AMHCA 4 ℃孵育過夜。再加入1∶80 000異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗人IgG(Sigma)37 ℃溫育1 h。通過激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV500)觀察心肌細胞上熒光結合的情況。

Bradford法進行蛋白質定量。上樣量20-30 μg,用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離,轉NC膜。5%脫脂奶封閉后,分別加入1∶1 000小鼠抗大鼠p53單克隆抗體(Abcam)和1∶1 000兔抗大鼠Bcl-2多克隆(PharMingen)抗體, 4 ℃孵育過夜,用含0.05%Tween-Tris緩沖鹽溶液洗3次,加入HRP標記的Ⅱ抗。顯色后,采用Gelwork凝膠圖像分析系統對膠片掃描,以對照組的面積灰度值為100%與實驗組進行比較和半定量分析。

實驗中，分別設置陰性對照和空白對照。將與抗原肽預孵后的AMHCA液和PBS液分別作為陰性對照和空白對照實驗的Ⅰ抗。

4凋亡檢測

4.1TUNEL 應用脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)觀察單個心肌細胞的凋亡。TUNEL試劑盒購自Roche，按試劑盒說明書檢測。

4.2Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡 應用Annexin V-FITC/PI雙染法標測凋亡的心肌細胞。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自Becton Dickinson，按試劑盒說明書檢測。通過流式細胞術和相應的軟件，檢測和計算凋亡的心肌細胞數。

5免疫印跡

收集心肌細胞、裂解,提取胞漿蛋白和核蛋白。 Bradford法進行蛋白質定量。上樣量20-30 μg,用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離,轉NC膜。5%脫脂奶封閉后,分別加入1∶1 000小鼠抗大鼠p53單克隆抗體(Abcam)和1∶1 000兔抗大鼠Bcl-2多克隆(PharMingen)抗體, 4 ℃孵育過夜,用含0.05%Tween-Tris緩沖鹽溶液洗3次,加入HRP標記的Ⅱ抗。用ECL顯色并曝光于X膠片。采用Gelwork凝膠圖像分析系統對膠片掃描,以對照組的面積灰度值為100%與實驗組進行比較和半定量分析。

6膜片鉗記錄

心肌細胞臺氏液復鈣后通過EPC-9膜片鉗放大器(HEKA)在全細胞模式下記錄ICa-L。電極經兩步法拉制后，充以ICa-L電極內液(mmo/L): CsCl 120, CaCl21.0, MgCl25, MgATP5,EGTA 11, Hepes 10，葡萄糖 11(CsOH調 pH 7.3)。保持電位-80 mV，先給予100 ms，-40 mV的去極化脈沖滅活鈉通道和T型鈣通道，再給予300 ms、0 mV的去極化脈沖可記錄到ICa-L。給予階躍10 mV，-40～+60 mV系列去極化脈沖，可記錄不同鉗制電壓下的ICa-L。數據采集及分析處理由Pulse 和Pulsefit軟件(HEKA)完成。

7胞內Ca2+濃度測定

新鮮分離的心肌細胞用10 mg/L Fluo-3AM和0.03% pluronic F-127(Sigma)37 ℃避光負載30 min。與Ca2+結合的Fluo-3可被488 nm的氬離子激光激發，發射波長526 nm，細胞內熒光強度(fluorescent intensity,FI)變化可指示加入AMHCA前后細胞內游離Ca2+濃度[Ca2+]i的相對變化。于激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV500)下連續動態掃描。

8統計學處理

結 果

1AMHCA與心肌細胞的結合

免疫印跡結果顯示，急性心肌梗死患者外周血中純化的AMHCA能識別心肌細胞200 kD的蛋白質分子，見圖1A。免疫熒光結果顯示，加入AMHCA的玻片上能觀察到沿桿狀心肌細胞分布的綠色熒光，見圖1B。而對照組觀察不到綠色熒光和蛋白條帶。

Figure 1. AMHCA binding to cardiomyocytes.A: A1, 200 kD protein band recognized by the purified AMHCA in sera from patients with AMI;A2, 200 kD protein band didn’t recognize by AMHCA which was pre-incubated with peptide(negative control experiment);A3, 200 kD protein band didn’t recognize by PBS(control experiment).B: cardiomyocyte membrane stained by immunofluorescence(×400).

2AMHCA誘導心肌細胞凋亡

通過TUNEL法(圖2)和Annexin V-FITC/PI雙染法(圖3)觀察AMHCA誘導的心肌細胞凋亡。與1.0×1010mmol/L AMHCA孵育24 h后，觀察到TUNEL染色陽性的凋亡心肌細胞，見圖2B。Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術可定量測定心肌細胞凋亡比例。AnnexinV+/PI-染色的凋亡心肌細胞位于右下象限，見圖3B。AMHCA誘導的心肌細胞凋亡比例顯著增加(P<0.01)。AMHCA誘導心肌細胞凋亡比例呈濃度依賴性。1.0×102mmol/L、 1.0×106mmol/L和1.0×1010mmol/L的AMHCA分別致心肌細胞凋亡比例為3.57%±0.13%、14.96%±4.60%和19.49%±3.27%。

3P53蛋白表達上調和Bcl-2蛋白表達下調

與對照組相比，1.0×1010mmol/L AMHCA顯著增加P53核蛋白的表達，下調Bcl-2胞漿蛋白的表達，見圖4。

Figure 2. Cardiomyocyte apoptosis detected by TUNEL(×400).A: cardiomyocytes in the absence of AMHCA as a control; B: apoptotic cardiomyocytes in the the presence of AMHCA. The nuclei of apoptotic cardiomyocytes were stained with brown color.

Figure 3. The percentage of apoptotic cardiomyocytes assayed by Annexin-V/PI double-staining flow cytometry.A and B: the number of AnnexinV+/PI- staining cells at lower right quadrant represents the percentages of apoptotic cardiomyocytes in the absence(A) or presence(B) of 1.0×1010 mmol/L AMHCA; C: the percentages of apoptotic cardiomyocytes in the presence of AMHCA increased in a concentration-dependent manner.±sE.n=4.**P<0.01 vs control.

Figure 4. Effects of AMHCA on the expression of P53 nucleoprotein and cytoplasmic protein Bcl-2 in cardiomyocytes.A: P53 nucleoprotein expression of cardiomyocytes in the presence(1) and the absence(2) of 1.0×1010 mmol/L AMHCA; B:cytoplasmic protein Bcl-2 expression of cardiomyocytes in the presence(1) and the absence(2) of 1.0×1010 mmol/L AMHCA. ±sE. n=4.**P<0.01 vs control.

4AMHCA對ICa-L的影響

比較AMHCA對-40 mV～+60 mV測試電壓下心肌細胞ICa-L電流密度的影響。如圖5所示，1.0×1010mmol/L AMHCA不增加或減少ICa-L的電流密度(n=6,P>0.05)。這提示AMHCA對細胞上L-型鈣通道沒有影響，不是通過該途徑對胞內鈣濃度進行調節。

Figure 5. Effect of AMHCA on I-V relationship of ICa-L.Circle dot and triangle mark respectively represent current densities of ICa-L before and after the addition of 1.0×1010 mmol/L AMHCA.

5AMHCA對[Ca2+]i的影響

通過測定心肌細胞內FI，觀察AMHCA對心肌細胞[Ca2+]i的影響。加入1.0×1010mmol/L AMHCA后，FI增加141.0%±10.56%(n=7,P<0.01)，提示AMHCA能增加心肌細胞[Ca2+]i，見圖6。

討 論

本研究顯示，AMHCA在急性心肌梗死的患者中不僅僅作為免疫標志物，且還能發揮病理學效應。AMHCA可以通過上調核蛋白P53、下調胞漿蛋白Bcl-2的表達來誘導大鼠心肌細胞凋亡,同時AMHCA也可以導致細胞內鈣離子濃度的增加。

越來越多的證據表明，針對心肌肌球蛋白的細胞和體液免疫應答與自身免疫性心肌病及擴張型心肌病密切相關[10]。心肌炎時，由于病毒感染致心肌肌球蛋白暴露，從而使其成為一種自身抗原啟動免疫應答。細胞免疫是自身免疫性心肌病及擴張型心肌病的一種重要的致病因素，而抗心肌肌球蛋白抗體也發揮了重要的作用。業已證明，抗心肌肌球蛋白抗體與慢性心肌炎和心肌病患者心功能的惡化相關[11]。此外，免疫吸附這些患者循環中的自身抗體可以改善擴張型心肌病患者的心功能。進一步的動物實驗闡明了抗心肌球蛋白自身抗體在自身免疫性心臟病和擴張型心肌病中的作用。將抗心肌球蛋白單克隆抗體轉輸給特定品系的小鼠可導致擴張型心肌病的發生[12]。同時也觀察到循環中抗心肌肌球蛋白自身抗體和IgG在心肌組織中沉積。抗心肌肌球蛋白單克隆抗體可以和β腎上腺素能受體產生交叉反應，并激動β腎上腺素能受體致心肌細胞內鈣超負荷[13]。

Figure 6. Effect of AMHCA on fluorescent intensity.A1: fluorescent imaging before the addition of 1.0×1010 mmol/L AMHCA; A2-A4: fluorescent imaging after the addition of 1.0×1010 mmol/L AMHCA with a scanning interval of 10 s;B: fluorescent intensity alteration curve before and after the addition of 1.0×1010 mmol/L AMHCA.

如同心肌炎和擴張型心肌病患者抗心肌肌球蛋白自身抗體的產生，急性心肌梗死的患者心肌壞死后，心肌球蛋白重鏈暴露誘導產生AMHCA。由于心肌球蛋白重鏈和β1-腎上腺素能受體分子氨基酸序列具有相似性，因此AMHCA能與β1-腎上腺素能受體結合。

心肌細胞凋亡是急性心肌梗死、心室重塑的重要病理改變，是導致心肌細胞減少的主要原因，從而造成心肌功能和結構的損害。而促凋亡基因p53表達和抑凋亡基因bcl-2表達的平衡則決定了細胞凋亡與否[14]。多種細胞內由P53激活的信號途徑可以闡明依賴于P53的細胞凋亡。轉錄因子P53調節它的靶基因通過結合DNA共有序列和激活共有序列下游基因(包括c-myc、ICE、fas和bax)啟動因子。新生大鼠心肌細胞受缺氧干預時, P53激活的p21/WAF-1/CIP-1的表達導致了細胞凋亡[15]。P53的表達也有促使細胞內鈣離子增加的趨勢。因此p53基因及其蛋白能加速心肌細胞凋亡。與此相反,bcl-2基因及其蛋白則有可能通過抑制P53的表達而減緩心肌細胞凋亡。大量證據表明bcl-2基因及其蛋白調節內質網的鈣溢出和細胞內cGMP的濃度從而實現它的抗凋亡作用[16]。而胞漿內鈣離子濃度也可調節細胞凋亡。我們的實驗結果提示，AMHCA可以增加心肌細胞內鈣離子濃度,從而導致細胞凋亡。本研究提示了AMHCA引起心肌細胞凋亡的一種可能機制。

總之，急性心肌梗死患者體內的AMHCA作為一種新的觸發因素，可誘導心肌細胞凋亡。該研究合理地闡明了AMHCA在急性心肌梗死后的心肌凋亡中的作用和機制。這有助于闡釋AMHCA陽性的急性心肌梗死患者的臨床癥狀較重，也為在急性心肌梗死患者中檢測AMHCA及以AMHCA為干預的靶點提供了實驗依據。

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Anti-cardiacmyosinheavychainantibodiesisolatedfrompatientswithacutemyocardialinfarctioninduceratcardiomyocyteapoptosis

SHAO Liang, LIU Kun, WANG Li, DING Yan-ping, LIAO Yu-hua, WANG Zhao-hui

(DepartmentofCardiology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China.E-mail:wwwzh@public.wh.hb.cn)

AIM: To study the effect of human anti-cardiac myosin heavy chain antibodies(AMHCA) on rat cardiomyocyte apoptosis.METHODSRat cardiomyocytes were isolated by the method of enzymolysis. Apoptosis of the cardiomyocytes was observed and measured by DNA end labelling and Annexin-V/PI double-staining assay. The proteins levels of apoptosis related P53 and Bcl-2 and the second messenger calcium were measured by Western blotting, patch clamp and confocal calcium imaging, respectively.RESULTSAMHCA was able to induce cardiomyocyte apoptosis in a dose dependent manner. In the presence of AMHCA, apoptosis-accelerating nucleoprotein P53 promoted myocardial apoptosis, while apoptosis-inhibiting cytoplasmic protein Bcl-2 inhibited myocardial apoptosis. Meanwhile, the concentration of cytoplasmic calcium was elevated. No effect of AMHCA on L-type calcium currents was observed.CONCLUSIONAs a novel triggering factor, AMHCA isolated from the patients with AMI induces cardiomyocyte apoptosis.

Myocardial infarction; Cardiac myosin heavy chain; Apoptosis; Protein P53; Protein Bcl-2; Calcium

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-001

1000-4718(2011)02-0209-06

2010-08-27

2010-10-21

國家973重點基礎研究發展規劃基金資助項目(No.2007CB512000；子課題No.2007CB512005)

△通訊作者 Tel：027-85726209；E-mail: wwwzh@public.wh.hb.cn