MuRF-1在大鼠心肌梗死后慢性心衰心臟中的表達變化及其分子機制的探討*

戴翠蓮, 張 赟, 姜黔峰

(遵義醫學院附屬醫院心內科， 貴州 遵義 563003)

MuRF-1在大鼠心肌梗死后慢性心衰心臟中的表達變化及其分子機制的探討*

戴翠蓮△, 張 赟, 姜黔峰

(遵義醫學院附屬醫院心內科， 貴州 遵義 563003)

目的研究肌肉環指蛋白1(MuRF-1)在心肌梗(MI)死后慢性心衰大鼠心臟中的表達變化及其分子機制，對心功能及心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的影響及其與cTnI的關系。方法將48只制作成功的心肌梗死大鼠及假手術大鼠納入研究，分為sham組、MI組、MG-132組及TNF-α組，檢測各樣本血流動力學指標及血清N末端原腦鈉肽水平(NT-proBNP)，觀察心肌組織學變化；原位雜交及real-time PCR法半定量測定心肌組織MuRF-1及cTnI mRNA表達，Western blotting法確定心肌MuRF-1及cTnI蛋白質水平，并對MuRF-1及cTnI的相關性進行分析。結果與MI及TNF-α組相比，MG-132能夠顯著降低NT-proBNP(P<0.05)，使心衰的發生率及死亡率有下降趨勢，心肌組織損傷減輕，并使大鼠左心室收縮壓(LVSP)升高(P<0.01)，左心室等容收縮期室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)增加(P<0.01)，左心室舒張末壓(LVEDP)明顯降低(P<0.01)。與sham組相比，MI組MuRF-1的mRNA及蛋白質表達均顯著升高(P<0.05)，cTnI水平降低(P<0.05)； MG-132能夠明顯降低心肌梗死后MuRF-1表達(P<0.05)，升高cTnI水平(P<0.01)；TNF-α則起相反作用。相關性分析顯示，MuRF-1與cTnI呈顯著負相關(P<0.01)。結論MuRF-1在慢性心衰中表達顯著升高，使心功能損害加重，其作用通過抑制cTnI表達而實現；抑制蛋白酶體活性能夠通過抑制MuRF-1表達而升高cTnI水平，改善心功能。MuRF-1的激活可能是慢性心力衰竭的機制之一。

心力衰竭； 肌肉環指蛋白-1； 肌鈣蛋白Ⅰ

心肌梗死后心室重塑是慢性心力衰竭的主要原因，左心室擴張、存活心肌細胞病理性肥大及某些胚胎基因的再表達是其主要特征[1]。作為鈣離子受體的肌鈣蛋白在心肌收縮狀態中起著重要作用，研究發現，心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)可能是E3 泛素連接酶肌肉特異性環指蛋白(muscle ring finger 1, MuRF-1)的特異靶蛋白。E3泛素連接酶MuRF-1與肌小節粗肌絲的肌聯蛋白結合[2]，并且兩者的相互作用可以調節肌原纖維M帶結構的穩定性[3]。本實驗以心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠為觀察對象，通過上調或者減少MuRF-1的表達，以研究MuRF1在心肌梗死后慢性心衰中的作用，并對cTn I 與MuRF-1相關性進行研究，結果有助于為心室重塑機制提供新觀點，并從肌肉萎縮途徑為慢性心衰的預防提供新方法。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 SD(Sprague-Dawley)大鼠60只，體質量(220±50)g，雌雄各半(購于第三軍醫大學實驗動物中心),雌雄分籠飼養。

1.2主要試劑 蛋白酶體抑制劑MG-132(N-[(phenylmethoxy)carbonyl]-L-leucyl -N-[(1S)-1-formyl-3-methylbutyl]-L-leucinamide)購于Calbiochem。大鼠N-末端原腦鈉肽(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP) ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)試劑盒購于PhoenixPeptide。腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor alpha，TNF-α)購于Sigma。MuRF-1兔抗大鼠多克隆抗體(SC-32920),及3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔抗大鼠多克隆抗體購于Santa Cruz。cTnI小鼠抗大鼠單克隆抗體(ab27972)購于Abcam。RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、Trizol 及引物設計均為TaKaRa產品。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒購于北京中衫金橋生物有限公司。PVDF膜為Biometra產品。MuRF-1及cTnI原位雜交試劑盒購于上海羅氏公司。BL-410生物機能實驗系統為成都泰盟科技有限公司產品。

2方法

2.1動物模型和實驗分組 TNF-α及MG-132實驗使用劑量分別參考文獻[4, 5]。慢性心力衰竭模型參照文獻[6]并加以改進。同窩出生的成熟大鼠，以3.5%水合氯醛腹腔內注射麻醉后接心電圖機，氣管插管后接小動物呼吸機。于胸骨左緣0.5 cm切開皮下組織，減斷第3、4肋骨，暴露胸腔。減開心包，暴露動脈圓錐和左心耳根部間的左冠狀靜脈，以其為標志，于左冠狀動脈前降支(left anterior descending, LAD)發出約2 mm處穿線后打死結，以阻斷其血流，造成心肌梗死。假手術組模型制作相同，但只穿線通過LAD不打結。以心電圖改變和心肌顏色變化作為心肌梗死模型成功的標志。

根據不同的干預手段，將造模成功且24 h后仍存活的48只大鼠隨機分為4組，每組12只，并立即進行以下處理：(1)MG-132組：腹腔內注射0.1 mg·kg-1·d-1的MG-132 (溶于2 mL生理鹽水)；(2)TNF-α組：腹腔內注射100 ng·g-1·d-1TNF-α (溶于2 mL生理鹽水)；(3)心肌梗死(MI)組：腹腔內注射2 mL·d-1生理鹽水；(4)假手術(sham)組：腹腔內注射2 mL·d-1生理鹽水。所有腹腔內注射持續7周。

2.2檢測指標及方法

① 計算動物心衰發生率及存活率 心衰判斷：精神萎靡、飲食差、活動減少、皮膚松弛、毛色欠光亮、氣促，并且尸檢發現肝淤血、肺淤血伴或不伴胸腔積液、腹腔積液，并結合血流動力學結果進行判斷。

② 血流動力學檢測 7周后再次給予大鼠3.5%水合氯醛腹腔內注射麻醉，接呼吸機，縱形切開右頸部皮膚約1.5-2 cm，分離出右側頸總動脈。結扎頸總動脈遠心端，關閉頸總動脈近心端。剪開頸動脈并插入1 mm的預先充滿肝素鹽水的聚乙烯導管，導管另一端與電生理記錄儀壓力感受器相連，導入BL-410生物機能實驗系統測得左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、心率(heart rate, HR)，同時同步輸入微分器描記曲線，測得左心室等容收縮期室內壓最大上升速率(the maximum rate of left ventricular pressure rise, +dp/dtmax)、左心室等容舒張期室內壓最大下降速率(the maximum rate of left ventricular pressure decrease,-dp/dtmax)。

完成血流動力學檢測后，于腹腔內再次注入致死量的水合氯醛，右頸總動脈取血，開胸并摘取心臟，迅速分離出左心室，并從結扎點開始沿長軸橫切成2 mm的薄片。取第1片心肌組織制作石蠟包埋切片用于原位雜交及HE染色，第2及第3片分別-80 ℃保存用于熒光定量PCR及Western blotting檢測。

③ 組織學觀察 將石蠟包埋后心肌組織切成5 μm薄片，用蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色后顯微鏡下觀察梗死邊緣心肌結構變化。

④ NT-proBNP水平 分離血清，采用雙抗體夾心 ABC-ELISA(avidin-biotin-peroxidase complex enzyme-linked immunosorbent assay) 法檢測NT-proBNP水平，嚴格按照說明書操作。配制好標準品，并將待測樣品做10倍稀釋。將標準品及待測樣品加入96孔板中，每孔100 μL，充分混勻后置37 ℃ 2 h；洗板3次加第Ⅰ抗體工作液100 μL，混勻后置37 ℃ 1 h；洗板5次并加酶標抗體工作液100 μL，將反應板置37 ℃ 30 min；洗板5次，加入底物工作液100 μL，室溫暗處反應30 min，加入100 μL終止液混勻，用酶標儀在450 nm處測吸光度值。

⑤ 原位雜交法檢測MuRF-1及cTnI的mRNA表達水平 嚴格按照說明書操作。石蠟切片脫蠟至水，置打孔液中室溫10 min后置過氧化氫封閉液室溫20 min，預雜交1 h；滴加雜交工作液覆蓋組織37 ℃過夜，分別用0.2× SSC(標準檸檬酸鹽溶液,standard saline citrate)及0.1 mol/L TBS(三乙醇胺緩沖鹽水溶液,triethanolamine-buffered saline solution)洗滌，滴加小鼠抗地高辛生物素標記的抗體工作液37 ℃孵育45 min后，辣根過氧化物酶37 ℃孵育45 min；DAB顯色，光學顯微鏡下觀察，當細胞內胞漿陽性顏色與細胞外背景顏色對比度反差明顯時，蒸餾水終止反應。細胞漿顯棕黃色顆粒為陽性反應，蘇木素復染，胞核為藍色。自來水充分沖洗，脫水透明、封片。高倍鏡下(×200)觀察MuRF-1及cTnI的mRNA表達情況：在每一張切片的梗死邊緣區域隨機選10個視野，用HPLAS-1000圖像分析系統計算吸光度(absorbance，A)值，計算其平均值。

⑥ 熒光定量PCR半定量檢測MuRF-1及cTnT mRNA表達 提取心肌總RNA(按照說明書進行) ，計算RNA的純度，進行逆轉錄反應( TaKaRa) ，合成的cDNA儲存在-20 ℃條件下備用。以β-actin為內參照, 引物如下：cTnI上游5’-ACCTATGCCGGCAGCTTCA-3’，下游5’- GAGAGTGGGCCGCTTAAACTTG-3’；MuRF-1上游5’-GGGAACGACCGAGTTCAGACTATC-3’，下游5’-GGCGTCAAACTTGTGGCTCA-3’;β-actin上游5’-GCGAGAAGATGACCCAGATC-3’，下游5’-CCAGTGGTACGGCCAGAGG-3’。制備cDNA的逆轉錄體系為5×PrimeScriptTMbuffer 2 μL，PrimeScriptTMRT enzyme mixⅠ0.5 μL，oligo-dT primer 0.5 μL，random 6-mers 0.5 μL，RNA 1 μL。反應參數為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，循數1次。定量PCR檢測在LightCycler熒光定量PCR儀上進行。20 μL反應體系，反應液中包括SYBR Premix ExTaqTM10 μL，PCR forward primer及PCR reverse primer各0.5 μL，ddH2O 8 μL，模板cDNA 1 μL。cTnI、MuRF-1及β-actin的PCR反應條件為95 ℃ 3 min，1個循環，95 ℃ 30 s、61.6 ℃ 30 s 40個循環。每份標本設3個復孔，取其循環閾值(Ct)均值，分別計算各組的△C(△Ct=CtMuFR1/cTnI-Ctβ-actin)，再依公式△△Ct =△CtMuFR1/cTnI-△Ctβ-actin計算△△Ct，2-△△Ct為模板中目的基因的相對比值。

⑦ Western blotting檢測 MuRF-1及 cTnI 蛋白質水平 提取心肌總蛋白(按照說明書進行)，BCA-100法測定蛋白含量。取100 μg等量蛋白經10%SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上，用含5%脫脂奶封閉1 h后分別與兔抗大鼠MuRF-1、小鼠抗大鼠cTnI及兔抗大鼠GAPDH抗體(以TBS稀釋，濃度分別為1∶200、1∶500、1∶200)室溫孵育2 h；洗膜后與Ⅱ抗(兔抗小鼠及山羊抗兔IgG)室溫孵育1 h，化學發光顯影，凝膠成像系統拍照、掃描分析。用UVP公司LabWorks 4.5軟件對條帶進行定量分析，以目的條帶和GAPDH條帶積分吸光度比值作為半定量結果。

3統計學處理

結 果

1心衰發生率及生存率

7周后sham組大鼠無心衰發生，MI組、MG-132組及TNF-α組分別有9只、6只和10只發生心衰，其發生率為75%、50%和83%。與sham組相比，MI組和TNF-α組心衰的發生率顯著增加(P<0.05)，而MG-132組較MI組有下降趨勢。MI組2只死于心衰，TNF-α組3只死于心衰，MG-132組無死亡。對以上組各取6只存活且發生心衰的大鼠進行研究并用于統計學分析。

2血流動力學檢測結果

圖1結果顯示，與sham組相比，MI組的心率明顯增快，LVSP降低，LVEDP增高，+dp/dtmax及-dp/dtmax均降低，差異均顯著(P<0.01)，TNF-α組更進一步加重了心功能損害；與MI組和TNF-α組比較，MG-132組上述心功能指標得到改善，且差異均顯著(P<0.01)。

Figure 1. Cardiac hemodynamic changes. The myocardial infarction model in rats was induced by ligating left anterior descending coronary artery. For sham surgical operating, left anterior descending coronary artery was not ligated. The rats,which survived 24 h after modeling, were treated with proteasome inhibitor MG-132, TNF-α or saline by intraperitoneal injection. Sham: sham group; MI: myocardial infarction group; MG-132: MG-132 group(MI rats treated with MG-132 for 7 weeks, 0.1 mg·kg-1·d-1, ip); TNF-α: tumor necrosis factor α group(MI rats were treated with TNF-α for 7 weeks, 100 ng·kg-1·d-1,ip); LVSP: left ventricular systolic pressure; LVEDP: left ventricular end-diastolic pressure;+dp/dtmax: the maximum rate of left ventricular pressure rise; -dp/dtmax: the maximum rate of left ventricular pressure decrease. ±s. n=6.**P<0.01.

3病理形態學

HE染色結果顯示，與sham組相比，MI組及TNF-α組可見大片心肌壞死，疤痕組織形成，結締組織增生，炎癥細胞浸潤，殘存心肌水腫；尤以TNF-α組為重，僅可見島狀心肌結構。MG-132組上述損害減輕，見圖2。

4NT-proBNP水平

與sham組相比，MI組NT-proBNP水平明顯增高(P<0.01)；TNF-α組較MI組進一步增加；與MI組及TNF-α組比較，MG-132組NT-proBNP水平均顯著降低(P<0.01),見圖3。

5RT-PCR檢測MuRF-1及cTnI的mRNA表達(圖4)

5.1MuRF-1 mRNA表達水平 Sham組MuRF-1 mRNA呈低水平表達，與其相比，MI組則顯著增加(P<0.05)，TNF-α組更進一步上調了MuRF-1 mRNA水平。與MI組和TNF-α組相比，MG-132則使MuRF-1的表達顯著降低(P<0.05)。

Figure 2. Left ventricular myocardial infarction sections stained with hematoxylin-eosin(×200). A: sham group； B: MI group; C: MG-132 group; D: TNF-α group.

Figure 3. Detection of plasma NT-proBNP level. NT-proBNP: N-terminal pro-brain natriuretic peptide. Sham: sham group; MI: myocardial infarction group; MG-132: MG-132 group; TNF-α: tumor necrosis factor α group.±s.n=6.**P<0.01.

5.2cTnI的mRNA表達水平 MI組cTnI為0.63±0.26，明顯低于sham組(1.78±0.89)，差異顯著(P<0.05)。與MI組相比，MG-132組cTnI表達量顯著增加(P<0.01)；TNF-α組cTnI的表達量(0.20±0.04)則明顯低于MI組(P<0.01)。

5.3MuRF-1與cTnI mRNA表達量的相關性分析 對4組大鼠心肌中MuRF-1和cTnI的mRNA 表達量進行相關性分析，結果顯示MuRF-1與cTnI之間呈負相關，相關系數r=-0.56，P<0.01。

6原位雜交(圖5)

6.1心肌MuRF-1吸光度(A)值 與sham組比較，MI組MuRF-1 mRNA 的A值為208.52，差異顯著(P<0.01)。與MI組比較，MG-132組顯著下調了MuRF-1的表達(A=143.63，P<0.01)，但高于sham組；TNF-α組顯著上調了MuRF-1的水平。

6.2心肌cTnIA值 與sham組比較，MI組cTnI mRNA的表達量降低(P<0.01)，差異顯著。與MI組相比較，MG-132組cTnI mRNA的表達量有升高趨勢(P<0.01)，TNF-α組cTnI mRNA的表達量則顯著降低(P<0.01)。

6.3MuRF-1與cTnI mRNA吸光度值相關性分析 相關性分析結果顯示，MuRF-1與cTnI的mRNA 表達量呈明顯負相關(r=-0.83，P<0.01)。

7Westernblotting檢測MuRF-1與cTnI的蛋白質水平(圖6)

7.1MuRF-1的蛋白質表達水平 經內參照校正后，MI組MuRF-1蛋白質水平明顯高于sham組，差異顯著(P<0.01)。與MI組相比較，MG-132抑制了MuRF-1蛋白質水平(P<0.05)，但仍高于sham組。而TNF-α則顯著上調了MuRF-1的蛋白質表達(P<0.01)。

Figure 4. Quantification of MuRF-1(A) and cTnI(B) mRNA expression as well as correlation analysis between the expression of MuRF-1 and troponin I(C) in the myocardium were measured by real-time PCR. Sham: sham group; MI: myocardial infarction group; MG-132: MG-132 group; TNF-α: tumor necrosis factor-α group. ±s. n=6.*P<0.05,**P<0.01.

Figure 6. Relative protein expression of MuRF-1(A, C) and cTnI(B, C) as well as the correlation of MuRF-1 and cTnI(D) in the myocardium. Relative protein expression of MuRF-1 and cTnI was quantified densitometrically using the LabWorks 4.5 software and calculated according to the GAPDH reference bands. Sham: sham group; MI: myocardial infarction group; MG-132: MG-132 group; TNF-α: tumor necrosis factor α group. ±s. n=6. *P<0.05,**P<0.01.

7.2cTnI的蛋白質表達水平 經內參照校正后，與sham組相比較，MI組cTnI蛋白質表達明顯降低(P<0.01)，差異顯著。與MI組相比，MG-132組cTnI蛋白質表達量明顯增加(P<0.01)，TNF-α組cTnI蛋白質表達明顯降低，差異顯著(P<0.01)。

7.3MuRF-1與cTnI蛋白質表達相關性分析 對4組大鼠心肌MuRF-1和cTnI的蛋白質表達量進行相關性分析，結果顯示MuRF-1與cTnI之間呈顯著負相關(r=-0.93，P<0.01)。

討 論

本實驗對心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠進行研究，結果顯示，心肌梗死后7周大鼠心功能顯著惡化，心肌結構紊亂；TNF-α使上述心肌損害加重，其機制可能是通過上調MuRF-1的水平，加速心肌cTnI降解所致。當使用蛋白酶體抑制劑MG-132后，MuRF1表達降低，cTnI水平升高，大鼠的心肌結構和心功能得到改善。

本實驗中，MG-132組大鼠慢性心力衰竭的發生率為50%，較心肌梗死組(75%)有下降趨勢；與MG-132組相比，MI組和TNF-α組的死亡率有增加趨勢，無明顯差異的原因可能主要在于樣本量較小。但結果說明抑制蛋白酶體系統能夠使心衰大鼠的死亡率、心肌梗死后心衰的發生率有下降趨勢。而且，MG-132還顯著降低了MI組大鼠的左室舒張末壓，使左室最大收縮速率增加，作為慢性心力衰竭重要指標之一的NT-proBNP[7]水平降低，改善了大鼠的心臟功能，再次印證了我們以前的研究結果[8]，即蛋白酶體抑制劑具有心肌保護作用，且能夠降低NT-proBNP水平。

心力衰竭的發生機制目前還不明確，越來越多的證據表明泛素蛋白酶體系統功能失衡是其重要原因。由于蛋白質合成及降解的精確調控維持了正常的心臟結構和功能[9]，蛋白質質量控制異常將會引起心肌纖維退化和心力衰竭的發生[10]，而作為蛋白質質量控制之一的泛素蛋白酶體系統可能起了重要作用。目前認為，與心肌萎縮相關的E3泛素連接酶MuRF-1與肌小節 M帶結構的穩定性[2, 3]有關，cTnI可能是MuRF1的底物之一且具有高度選擇性[11]。

由于蛋白酶體抑制劑MG-132能夠抑制26S蛋白酶體，從而阻斷E3泛素連接酶MuRF1的活性，而TNF-α能夠升高MuRF-1約3倍[12]。為研究與萎縮相關的MuRF-1在慢性心力衰竭中的作用，故本實驗特設MG-132組和TNF-α組作為對照研究，以抑制或者刺激MuRF-1表達，從而觀察MuRF1在慢性心衰中的作用。

本研究中，原位雜交和熒光定量PCR半定量結果均顯示，心肌梗死顯著增加了MuRF-1 mRNA水平，而cTnI表達則顯著降低，TNF-α卻使MuRF-1 mRNA水平更加升高，MG-132有效地抑制了MuRF-1 mRNA水平；Western blotting結果發現各組大鼠的MuRF-1與cTnI的蛋白質水平與其mRNA表達相吻合，而且MuRF1的mRNA水平和蛋白質水平均與cTnI表達呈顯著負相關。這與Conraads等[13]的研究結果一致。但他們發現在2周內發生心肌梗死的患者其遠離心肌梗死部位MuRF-1的表達水平降低、心肌肥厚，這與本研究結果不同，但本實驗動物為慢性心力衰竭樣本(心梗后7周)，與Conraads等[13]的樣本不同(心梗2周內)，而且該實驗只檢測了遠離心肌梗死部位的心肌組織，故具有一定的局限性，而且，近期研究表明，慢性心衰模型中泛素蛋白酶體的活性是被激活的[14]。因此，本實驗從基因水平及蛋白質水平均證明，心肌梗死后心力衰竭與心肌中MuRF-1的上調有關，而且MuRF-1 的上調加速了cTnI的降解，這可能是慢性心力衰竭的重要原因。這與體外研究報道一致[12]，而且研究還發現，MuRF-1轉基因大鼠的心臟表現出左心室壁變薄和心功能受損；在主動脈縮窄的模型中，MuRF-1轉基因大鼠可導致心臟快速衰竭，超生心動描記術顯示，與野生型大鼠相比，左心室的前壁與后壁的厚度分別減少了19.3%和19.8%，射血分數降低[15]。說明MuRF-1的過表達促進心肌梗死后心衰的發生。由于MuRF-1對cTnI的作用，意味著可能通過對MuRF-1的調節以減緩慢性心力衰竭心室重塑的進程。

本研究還證明，TNF-α能夠上調慢性心衰大鼠心臟的MuRF-1水平，可以做這樣的推測，即TNF-α對心肌的損害作用一個重要方面是通過上調MuRF-1實現的。由于cTnI的降解與心肌收縮力的損害有關[16]，cTnI降解越嚴重，單個心肌細胞收縮力越低[17]，cTnI的缺失可導致大鼠心肌收縮力的降低和心功能失常[15]。MuRF-1對cTnI具有特異性、靶向性降解的能力，因此通過腹腔內注射TNF-α增加MuRF-1的表達會影響cTnI的穩定性。體外研究[11]支持了本研究的結果。研究發現，增加MuRF-1的表達可以導致cTnI的半衰期縮短[11]。當用MG-132干預后，MuRF-1轉基因的大鼠中cTnI的水平增加了210%，免疫沉淀法發現MuRF-1增加cTnI的泛素化降解，MG-132增加了cTnI的水平。

MuRF-1對肌鈣蛋白的作用可能是通過調節其能量代謝和蛋白質合成而實現的。近期研究表明，MuRF-1的激活可以引起肌鈣蛋白翻譯異常[4]而導致骨骼肌收縮力降低，與丙酮酸脫氫酶和3-羥基脫氫酶有關[18]。因此，MuRF-1對于心梗后心衰心肌的作用是否也存在著能量代謝和蛋白合成與降解之間的協同偶聯機制還需要進一步證明。

本研究證明，在慢性心力衰竭的心肌中，cTnI是E3泛素連接酶MuRF1的底物蛋白，通過抑制泛素蛋白酶體系統能夠抑制MuRF1所致的泛素化降解，從而改善心功能。此研究為慢性心力衰竭的治療提供了新的治療思路。

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Transformationofmuscleringfinger1onchronicheartfailureinmyocardialinfarctionrats

DAI Cui-lian, ZHANG Yun, JIANG Qian-feng

(DepartmentofCardiology,TheAffiliatedHospital,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:dai_cui_lian@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the change and the mechanism of muscle ring finger 1(MuRF-1) on heart functions and cardiac troponin I(cTnI) in myocardial infarction rats and to analyze the correlation between MuRF-1 and cTnI.METHODSThe rats either with coronary artery ligation or with sham operation(48 rats) were divided into 4 groups: sham(sham-operated) group, MI(myocardial infarction) group, MG-132(N-[(phenylmethoxy)carbonyl]-L-leucyl-N-[(1S)-1-formyl-3-methylbutyl]-L-leucinamide) group and TNF-α(tumor necrosis factor alpha) group.The animals were treated with saline(sham and MI group),MG-132(MG-132 group) or TNF-α(TNF-α group) by intraperitoneal injection. Hemodynamics, N-terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP) and cardio-pathologic changes were observed. Both mRNA and protein expressions of MuRF-1 and cTnI in the left ventricles were determined by real-time PCR andinsituhybridization or by Western blotting. The correlation between MuRF-1 and cTnI was also analyzed.RESULTSCompared with MI group and TNF-α group, the mortality and the morbidity of the animals had a decreasing tendency in MG-132 group, and NT-proBNP level as well as the left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP) were significantly decreased(P<0.05 andP<0.01, respectively).Left ventricular systolic pressure(LVSP) and the maximum rate of left ventricular pressure rise(+dp/dtmax) were pronouncedly increased(P<0.01).The heart injury was also amended after MG-132 treatment. Compared with sham group, the mRNA and protein relative expressions of MuRF-1 were predominantly increased in MI group(P<0.05), and the cTnI levels were decreased (P<0.05). MG-132 depressed the level of MuRF-1(P<0.05) and enhanced the level of cTnI(P<0.01) at both mRNA and protein levels. In contrast, treatment with TNF-α worsened the heart failure,reduced the cTnI level and raised MuRF-1 level. The expression of MuRF-1 at mRNA and protein levels had significantly negative correlation with the expression of cTnI in all groups.CONCLUSIONThese data suggest that MuRF-1 is significantly increased in chronic heart failure and aggravates heart dysfunction by depressing cTnI level. Inhibition of proteasome activity diminishes MuRF-1 expression. MuRF-1 may be involved in the mechanism of chronic heart failure.

Heart failure; Muscle ring finger 1; Troponin Ⅰ

R541.05

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-002

1000-4718(2011)02-0215-08

2010-08-30

2010-10-27

國家自然科學基金資助項目(No. 30860295)

△通訊作者 Tel： 0852-8609001； E-mail: dai_cui_lian@yahoo.com.cn