脂肪分化相關蛋白真核表達載體的構建及其對H9c2心肌細胞增殖和凋亡的影響*

鮑苑苑, 方 舟, 周麗諾△, 胡仁明, 丁 薇

(復旦大學1附屬華山醫院內分泌科，2生命科學院，上海 200040)

脂肪分化相關蛋白真核表達載體的構建及其對H9c2心肌細胞增殖和凋亡的影響*

鮑苑苑1, 方 舟2, 周麗諾1△, 胡仁明1, 丁 薇1

(復旦大學1附屬華山醫院內分泌科，2生命科學院，上海 200040)

目的構建編碼脂肪分化相關蛋白(adipose differentiation-related protein, ADRP)基因全長序列的真核表達載體，探討ADRP過表達對軟脂酸誘導的H9c2心肌細胞凋亡有何影響。方法(1)RT-PCR擴增編碼ADRP全長的 DNA 序列，重組入pEGFP-C1質粒表達載體中，酶切、測序鑒定后轉化大腸埃希菌DH5α，挑取陽性克隆，擴增后提取質粒并進行鑒定；采用脂質體轉染法將鑒定后的重組質粒穩定轉染H9c2心肌細胞；熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白表達情況；RT-qPCR和Western blotting檢測ADRP表達情況；(2)采用MTT比色法和流式細胞術檢測不同濃度軟脂酸對細胞增殖和凋亡的影響。結果(1)成功構建了真核質粒表達載體pEGFP-C1-ADRP，轉染H9c2細胞后，熒光顯微鏡下觀察發現細胞內有綠色熒光蛋白表達；RT-qPCR和Western blotting顯示重組質粒轉染H9c2細胞ADRP mRNA和蛋白表達水平明顯高于空質粒轉染組和正常對照組(P<0.01)；(2)經不同軟脂酸刺激后，重組質粒轉染H9c2細胞增殖抑制率和凋亡率均明顯低于空質粒轉染組和正常對照組(P<0.05)。結論(1)成功獲得了穩定表達ADRP的H9c2心肌細胞株；(2)軟脂酸可抑制H9c2心肌細胞增殖并可誘導其凋亡，而ADRP高表達可對抗軟脂酸的這一作用，表明ADRP對高脂環境中心肌細胞可能具有一定的保護作用。

脂肪分化相關蛋白質； H9c2細胞； 棕櫚酸； 細胞凋亡

糖尿病心臟病是糖尿病患者死亡的最主要原因之一，其早期的臨床表現為心室舒張功能障礙，隨后可出現收縮功能受損，逐漸發展為充血性心力衰竭。糖尿病心臟病患者存在游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)過剩，可對心肌細胞造成損傷[1]。脂肪分化相關蛋白(adipocyte differentiation-related protein，ADRP)是細胞內脂滴表面PAT家族蛋白的一種。研究發現，ADRP可促進細胞對FFA的吸收并將其轉化為甘油三酯(triglyceride, TG)儲存于脂滴內[2]。目前ADRP與糖尿病的關系尚存在爭議，Minnaard等[3]認為糖尿病者ADRP水平升高可使細胞內FFA水平升高，對細胞造成一定的損傷；而Phillips等[4]則認為ADRP水平升高可使細胞內FFA轉化為TG從而避免損傷細胞。此外，ADRP在心肌病方面的研究報道少見。鑒于此，本研究構建ADRP高表達H9c2心肌細胞穩定株，并用軟脂酸(palmitic acid，PA)刺激，觀察ADRP高表達后對PA刺激心肌細胞增殖和凋亡的影響，可能為糖尿病心臟病的基因治療提供新的作用靶點。

材 料 和 方 法

1材料

1.1質粒、菌株和細胞株 原核質粒表達載體pEGFP-C1、大腸埃希菌株DH5α均由上海華山醫院中心實驗室提供，H9c2心肌細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑 編碼ADRP全長的DNA序列引物由上海生工生物工程公司合成；限制性內切酶BclⅡ和HindⅢ、T4 DNA連接酶及預染蛋白質分子量marker購于Fermentas；Trizol購于Invitrogen；SYBR green real-time PCR master mix、逆轉錄試劑盒購于Toyobo；高純度質粒小提中量提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、DL2000及D15000核酸電泳分子量標準、LipofectamineTM2000(Lipo 2000)購于Tiangen；PA、Opti-MEM購于Gibco；兔源性抗ADRP多克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP購于Sigma；Annexin Ⅴ-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購于BD；噻唑藍溴鹽(MTT)購于Ameresco。

2方法

2.1pEGFP-C1-ADRP 質粒表達載體的構建 采用主動脈逆行插管的方法[5]，收集大鼠心肌細胞，按照試劑盒步驟抽提總RNA并逆轉錄。以cDNA為模板，按PCR試劑盒說明擴增全長ADRP基因序列。擴增ADRP的引物為：上游5 ’-ccc aagctt gtt agg cgt ctc ttt tct cca-3’(下劃線為HindⅢ酶切位點)，下游5’-tgc ccgcgg ctg gtg aca agg agg ggt tta-3’(下劃線為SacⅡ酶切位點)。反應體系為30 μL，反應條件為：94 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 3.5 min,擴增35個循環。對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，并進行切膠回收純化、測序鑒定。用限制性內切酶BclⅡ和HindⅢ對擴增產物和表達質粒進行雙酶切，回收并純化后，用T4 DNA連接酶將擴增產物和表達質粒進行連接；將連接產物轉化E.coliDH5α大腸埃希菌，隨機挑取陽性克隆，擴增后提取質粒，進行酶切和測序鑒定。

2.2細胞培養及重組質粒穩定轉染 選取對數生長期細胞，以0.25% Trypsin消化，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基將細胞制成密度為1×109cells/L的單細胞懸液。培養24 h后細胞長至約80%融合時進行轉染。按照Lipo2000試劑盒說明操作，將pEGFP-C1-ADRP質粒轉染入H9c2心肌細胞內，并將空質粒pEGFP-C1轉染H9c2心肌細胞作為陰性對照，正常H9c2心肌細胞作為空白對照。繼續培養72 h后改用含G-418(500 mg/L)的選擇培養液繼續培養3周，正常H9c2細胞全部死亡，挑取具有抗性的單克隆擴增進行后續實驗。

2.3重組質粒在H9c2心肌細胞中穩定表達的鑒定

① 熒光顯微鏡間接觀察ADRP基因表達 經3周培養后，于倒置熒光顯微鏡下觀察質粒報告基因GFP的表達，間接監測目的基因ADRP表達情況，并對熒光顯微鏡下2種細胞形態變化進行觀察。

② 反轉錄定量PCR(RT-qPCR)檢測ADRP基因轉錄水平的表達 按Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明進行操作，逆轉錄后得到的cDNA為模板，按熒光定量PCR試劑盒說明進行擴增。引物為：上游5’-aag agg cca aac aaa aga gcc agg aga cca-3’，下游5’-acc ctg aat ttt ctg gtt ggc act gtg cat-3 ’。反應體系為20 μL，反應條件為： 95 ℃ 15 s,63 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,擴增40個循環，采用GAPDH基因作為內參照。

③ Western blotting檢測ADRP蛋白的表達 超聲法提取上述3種細胞總蛋白，BCA法測定其蛋白濃度，然后行SDS-10%PAGE電泳分離。電泳完畢后將蛋白電轉移至NC膜，然后用麗春紅染色觀察蛋白轉移情況，轉移液脫色后浸入5%脫脂牛奶溶液中室溫封閉2 h，PBST洗滌后加入兔源性抗ADRP抗體(1∶1 000)，室溫孵育3 h或4 ℃過夜，PBST洗滌后，加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶2 000)，室溫孵育1 h，PBST洗滌后用化學發光法顯色。采用GAPDH作為內參照。

2.4PA干預 分別用含1%BSA的DMEM高糖培養基和含有1%BSA及不同濃度PA的DMEM高糖培養基(按照Cousin等[6]文獻報道的方法配置PA/BSA混和溶液，經0.22 μm孔徑的濾膜過濾后經DMEM溶液倍比稀釋，得到PA濃度為0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L DMEM溶液)培養3種細胞48 h進行后續實驗。

2.5MTT比色法檢測心肌細胞增殖活力 選取對數生長期的3種細胞，以0.25%trypsin消化，用含10%小牛血清的DMEM培養液將細胞分散成密度為5×107cells/L的單細胞懸液，將細胞接種于96孔板，每孔200μL。培養24 h后換含有PA(終濃度分別為0.5 mmol/L、1 mmol/L和2 mmol/L)的培養液繼續培養，每種濃度組及對照組均做6個平行孔。分別處理24 h、48 h和72 h后，每孔加入新鮮配置的MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續孵育4 h。待測定時小心吸出孔內培養液，加入150 μL DMSO，振蕩混合器上振蕩10 min，使結晶物充分溶解，然后測定570 nm波長處各孔吸光度(A)值。抑制率按照以下公式計算：抑制率=(1-PA干預組平均A值/對照組平均A值)×100%。實驗重復進行3次。

2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 待測細胞用不含EDTA的trypsin消化收集，加入1 mL預冷PBS洗滌細胞2次后，將細胞重懸于500 μL binding buffer中，使其每孔濃度為109cells/L，加入5 μL Annexin V-PE混勻后室溫避光反應15 min，2 000 rpm/min離心10 min，棄去上清加入500 μL binding buffer和5 μL的7-AAD混勻避光反應10 min后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復進行3次。

3統計學處理

結 果

1重組質粒表達載體的構建

瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示，PCR擴增產物ADRP約1.2 kb,見圖1，測序鑒定結果與GenBank報道的完全一致(ADRP登錄號為BC085861，測序圖譜略)，無PCR引起的突變。用限制性內切酶SacⅡ和HindⅢ對重組質粒pEGFP-C1-ADRP進行雙酶切后，電泳分析，可見除了有4 700 bp的質粒載體譜帶外，還有相應目的基因片段大小的譜帶,見圖2。對重組質粒進行測序鑒定，結果與GenBank報道的完全一致(ADRP登錄號為BC085861，測序圖譜略)。

Figure 1. Electrophoresis analysis(2% agarose gel) of ADRP PCR products. Lane 1-4：ADRP; Lane 5: DL2000 DNA marker.

Figure 2. Identification of recombination vector by enzyme digestion. Lane 1:DL15000 DNA marker; Lane 2-4: digestive productsof pEGFP-C1-ADRP(4.7 kb and 1.7 kb); Lane 5: digestive product of pEGFP-C1; Lane 6: pEGFP-C1; Lane 7: DL2000 DNA marker.

2穩定轉染心肌細胞株的建立

2.1熒光顯微鏡觀察 倒置熒光顯微鏡下觀察發現，重組質粒轉染組細胞和空質粒轉染組細胞均有綠色熒光穩定表達，傳代20次以上仍無消失。

2.2重組質粒轉染細胞、空質粒轉染細胞和正常H9c2細胞ADRP mRNA的表達水平 從3種細胞中提取的總RNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外透射分析儀下觀察，顯示清晰的28S、18S 2條條帶，且28S∶18S約為2∶1，提示RNA提取完整、無降解；進一步檢測所有總RNA樣品的A260 nm/A280 nm值均大于1.8，表明總RNA純度較高，能滿足逆轉錄需求。熒光定量PCR結果如圖3所示，重組質粒轉染組細胞ADRP mRNA的表達水平明顯高于空質粒轉染組和正常H9c2細胞組細胞(P<0.01)，而空質粒轉染組細胞ADRP mRNA的表達水平與正常H9c2細胞組相比無顯著差異(P>0.05)。

Figure 3. Expression level of ADRP mRNA by RT-qPCR in H9c2 cells transfected with pEGFP-C1-ADRP or pEGFP-C1 and normal H9c2 cells. pEGFP-C1: H9c2 cells transfected with pEGFP-C1; pEGFP-C1-ADRP: H9c2 cells transfected with pEGFP-C1-ADRP.±s.n=3.**P<0.01 vs H9c2 cells transfected with pEGFP-C1 or normal H9c2 cells.

2.3重組質粒轉染細胞、空質粒轉染細胞和正常H9c2細胞ADRP蛋白的表達水平 Western blotting結果顯示：重組質粒轉染組細胞ADRP的表達水平明顯高于空質粒轉染組和正常H9c2細胞組細胞(P<0.01)，而空質粒轉染組細胞ADRP的表達水平與正常H9c2細胞組相比無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. Expression level of ADRP protein by Western blotting in H9c2 cells transfected with pEGFP-C1-ADRP or pEGFP-C1 and normal H9c2 cells. Lane 1: normal H9c2 cells; Lane 2: H9c2 cells transfected with pEGFP-C1-ADRP; Lane 3: H9c2 cells transfected with pEGFP-C1.

3PA對重組質粒轉染細胞、空質粒轉染細胞和正常H9c2細胞增殖的影響

如表1所示，不同濃度的PA對3種細胞生長均有一定的抑制作用，隨著PA濃度增大、作用時間延長，其對3種細胞增殖的抑制作用逐漸增強(P<0.05)，并且PA對3種細胞增殖的抑制作用均呈明顯的劑量-效應和時間-效應依賴關系。

表1 PA對正常H9c2細胞、空質粒轉染細胞和重組質粒轉染細胞增殖的影響

在同一PA處理濃度和相同處理時間下，重組質粒轉染組細胞抑制率明顯低于空質粒轉染細胞和正常H9c2細胞(P<0.05)，正常H9c2細胞與空質粒轉染細胞組相比抑制率無明顯差異(P>0.05)。

4PA對重組質粒轉染細胞、空質粒轉染細胞和正常H9c2細胞凋亡率的影響

流式細胞術分析顯示，PA處理3種細胞72 h后，與對照組相比，細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，并呈明顯的劑量效應依賴關系；同一PA濃度刺激時，空質粒轉染細胞凋亡率與正常H9c2細胞相比無明顯差異(P>0.05)，而重組質粒轉染組細胞凋亡率明顯低于空質粒轉染細胞和正常H9c2細胞(P<0.05)，表明ADRP基因可能對PA刺激引起的心肌細胞凋亡具有保護作用，見圖5。

Figure 5. Effect of PA at different doses on cell apoptosis of H9c2 cells transfected with pEGFP-C1-ADRP or pEGFP-C1 and normal H9c2 cells(72 h later). ±s.n=3.*P<0.05,** P<0.01 vs H9c2 cells or H9c2 cells transfected with pEGFP-C1

討 論

脂肪酸是心臟能量產生的主要來源，在多種疾病狀態下，心肌細胞脂肪酸代謝異?？梢鸺毎麅菷FA增高和脂代謝中間產物積聚，進而導致心肌收縮和舒張功能受損。動物實驗發現，糖尿病動物模型心肌細胞中FFA水平的升高可導致細胞胰島素抵抗的發生及細胞凋亡率的增加，從而加快了糖尿病心衰或心肌病的進程。近來研究發現，ADRP可通過促進高脂環境培養下骨骼肌細胞對FFA的吸收和轉化來降低細胞內FFA水平，從而避免FFA對骨骼肌細胞的損傷[3，4]，然而有關ADRP對高脂環境下心肌細胞的影響尚未見文獻報道。

H9c2心肌細胞來源于大鼠胚胎心臟組織，具有增殖能力強、易培養等特點，目前廣泛用于細胞周期調控相關基因表達、細胞增殖及凋亡等的研究[7]?；蜣D染進入細胞的方式主要有4種：電擊法、磷酸鈣法、脂質體介導法和病毒介導法。電擊法和磷酸鈣法實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法前期準備較復雜，費用較高，且可能對細胞有較大影響；而脂質體介導法與上述幾種方法相比，操作簡單，適用范圍廣，轉染效率較高，細胞毒性較低。本研究構建了含有EGFP報告基因的重組質粒pEGFP-C1-ADRP，并通過脂質體轉染法將其轉入H9c2細胞中。熒光顯微鏡下觀察發現重組質粒轉染細胞和空質粒轉染細胞均呈現明顯的綠色熒光，而未轉染的正常H9c2細胞則未見熒光；RT-qPCR與Western blotting結果顯示，與正常H9c2細胞和空質粒轉染細胞相比，重組質粒轉染細胞ADRP mRNA和蛋白的表達水平明顯升高(P<0.01)，這表明高表達ADRP心肌細胞穩定株構建成功。

本實驗采用MTT法觀察了PA對重組質粒轉染組、空質粒轉染組和正常H9c2細胞組細胞增殖的影響。結果顯示，PA對3種細胞的增殖均有一定抑制作用，并呈明顯的劑量-效應和時間-效應依賴關系；相同PA處理條件(相同濃度和作用時間)下，重組質粒轉染組細胞抑制率明顯低于空質粒轉染細胞和正常H9c2細胞(P<0.05)，表明ADRP基因高表達可對抗PA對H9c2心肌細胞增殖的抑制作用，即ADRP可能具有保護心肌細胞免于高脂環境損傷的作用。

研究發現，高脂環境(PA)可誘導微血管內皮細胞的凋亡，進而影響糖尿病腎病的發生發展[8]。那么PA對心肌細胞有何影響？將ADRP轉入細胞后可否對抗PA引起的細胞凋亡？基于此，我們采用不同濃度的PA刺激重組質粒轉染組、空質粒轉染組細胞和正常H9c2細胞，然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果發現，與對照組相比，經PA刺激后各組細胞凋亡率均有所增加，且具有明顯的劑量效應依賴性，推測其原因可能是PA使心肌細胞中長鏈酯酰輔酶A增多，非氧化代謝產物神經酰胺濃度升高，通過NF-κB介導，釋放細胞色素C，引起細胞凋亡[9]。進一步分析發現，相同PA濃度作用下，重組質粒轉染組細胞凋亡率明顯低于空質粒轉染組細胞和正常H9c2細胞組(P<0.05)，表明ADRP高表達也可通過抑制高脂環境誘導的H9c2心肌細胞凋亡來保護心肌細胞，推測原因可能是由于ADRP高表達使PA以TG的形式儲存在脂滴內，避免了PA對心肌細胞產生損傷。

綜上，我們成功建立了穩定表達ADRP的H9c2心肌細胞株，觀察到相同PA作用條件下重組質粒轉染組細胞增殖和凋亡率均明顯低于空質粒轉染組和正常H9c2細胞組細胞，表明ADRP可能對細胞內FFA升高造成的細胞損傷具有一定的保護作用。目前ADRP影響心肌細胞脂肪代謝途徑的研究較少，因此有關ADRP對高脂環境中心肌細胞保護作用的機制尚不清楚，有待于我們進一步研究。

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Effectofadiposedifferentiation-relatedproteinonproliferationandapoptosisinH9c2cells

BAO Yuan-yuan1, FANG Zhou2, ZHOU Li-nuo1, HU Ren-ming1, DING Wei1

(1DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,HuashanHospital,2AcademyforLifeScience,FudanUniversity,Shanghai200040,China.E-mail:zhoulinuo@yahoo.cn)

AIM: To construct an adipose differentiation-related protein(ADRP) eukaryotic expression vector and to explore the effect of ADRP on apoptosis of H9c2 cells induced by palmitic acid(PA).METHODSThe ADRP gene obtained by the method of RT-PCR was cloned into pEGFP-C1 plasmid. The recombinant plasmid was transformed intoE.coliDH5α for amplification. The recombinant plasmid was extracted fromE.coliDH5α and transfected into H9c2 cells by LipofectamineTM2000. The stable transformants were selected by G418 screening. Expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope and the ADRP expression was identified by RT-qPCR and Western blotting analysis. The effect of PA on the proliferation of H9c2 cells was detected by MTT assay. The apoptotic percentage of H9c2 cells caused by PA was determined by flow cytometry.RESULTSThe eukaryotic expression vector pEGFP-C1-ADRP was successfully constructed. Green fluorescent was observed in the cells transfected with pEGFP-C1 or pEGFP-C1-ADRP under fluorescence microscope. RT-qPCR and Western blotting analysis showed that recombinant cells exhibited high mRNA and protein levels of ADRP. After treated with PA at different concentrations, the apoptosis rates and the proliferation inhibition of recombinant cells were both lower than those of the other two cells.CONCLUSIONThe transfected H9c2 cells with stable ADRP expression were successfully established. The over-expression of ADRP prevents the cells from apoptosis and inhibition of proliferation caused by PA, indicating that ADRP plays a protective role in H9c2 cells.

Adipose differentiation-related protein; H9c2 cells; Palmitic acid; Apoptosis

R589.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-003

1000-4718(2011)02-0223-06

2010-10-08

2010-11-04

國家自然科學基金資助項目(No.30270627)

△ 通訊作者Tel：021-52888143；E-mail：zhoulinuo@yahoo.cn

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