缺血后處理對離體大鼠心肌線粒體功能的影響*

劉興奎， 段忠心 ， 喻 田

(遵義醫學院麻醉系，貴州 遵義 563003)

缺血后處理對離體大鼠心肌線粒體功能的影響*

劉興奎△， 段忠心#， 喻 田

(遵義醫學院麻醉系，貴州 遵義 563003)

目的建立離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，觀察缺血后處理對大鼠心肌線粒體功能的影響，并探討線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)在缺血后處理心肌保護中的作用。方法采用Langendorff裝置建立離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型。將SD大鼠隨機分為對照組(C)、模型組(M)、缺血后處理組(IPO)、5-羥癸酸拮抗缺血后處理組(5-HD+IPO)，每組8只。各組均先灌注平衡20 min，C組：續灌70 min；M組：缺血前灌注4 ℃ St.Thomas停跳液(10 mL/kg)，全心缺血40 min，復灌30 min；IPO組：全心缺血40 min，復灌前先開放10 s，缺血10 s，反復6次，時間為2 min，復灌28 min；5-HD+IPO組：缺血后處理前給予含5-羥癸酸(100 μmol/L)的K-H液灌注5 min，余同IPO組，復灌23 min。觀察各組平衡末與再灌注末心肌線粒體膜電位、氧自由基及呼吸功能的變化。結果(1)各組再灌注末心肌線粒體膜電位較平衡末顯著降低，而C組顯著高于其它3組，IPO組明顯高于5-HD +IPO與M組，5-HD +IPO組高于M組。(2)各組再灌注末與平衡末比較，心肌線粒體氧自由基含量顯著升高，其中M組顯著高于其它3組，5-HD +IPO組高于IPO及C組，IPO組高于C組。(3)各組再灌注末較平衡末線粒體呼吸功能明顯受損，且C組優于其它3組，IPO組優于5-HD +IPO與M組，5-HD +IPO組優于M組。結論(1)缺血后處理通過維護線粒體膜電位穩定、減少線粒體氧自由基的產生、保護線粒體呼吸鏈及功能，減輕心肌的再灌注損傷。(2)5-HD不能完全阻斷缺血后處理的心肌保護作用。 (3)缺血后處理的心肌保護效應可通過激活心肌mitoKATP實現，同時還有其它因素參與了缺血后處理的心肌保護。

線粒體功能； 缺血后處理； 再灌注損傷； 心肌

減輕心肌缺血/再灌注損傷一直是心肌保護研究的重點[1,2]。Zhao等[3]在研究中發現并首先提出了缺血后處理(ischemic post-conditioning，IPO)的概念：即在再灌注早期，重復給予幾次短暫冠脈閉塞與再通，可明顯減輕心肌再灌注損傷。Staat等[4]多次將缺血后處理用于臨床并發現可使心肌梗死程度減輕。Yang等[5]在兔心模型研究中證實IPO與ATP敏感性鉀通道(KATP)有關。本實驗用線粒體KATP(mitoKATP)抑制劑5-羥癸酸(5-hydroxydecanoate，5-HD)作為拮抗劑，觀察缺血后處理對離體大鼠缺血再灌注心肌線粒體功能的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物及分組 健康清潔級雄性SD大鼠64只，年齡16-20周，體重250-350 g，第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供。隨機分為4組：對照組(control group, C組)、模型組(model group, M組)、缺血后處理組(ischemic postconditioning group, IPO組)、5-HD拮抗缺血后處理組(5-HD+IPO組)。

1.2主要試劑 四甲基對苯二胺(tetramethyl-p-phenylene diamine，TMPD)、羰基氰酯-3-氯苯基腙(carbonyl cyanide-3-chlorophenylhydrazone，FCCP)、谷氨酸(glutamic acid，GAA)、羅丹明123(rhodamine 123)、蘋果酸、琥珀酸、魚藤酮、抗霉素A及5-羥癸酸(Sigma)；Amplex Red(Invitrogen)；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；其余試劑為國產分析純。

1.3主要儀器 Langendorff離體心臟灌注裝置(PanLab)；Powerlab/8SP實驗數據采集系統(ADInstrument)；內切式高速均質器(T8，IKA)；熒光分光光度計(Eclipse，Varian)。

2方法

2.1離體大鼠心臟模型的建立 腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)、肝素(250 U·kg-1)，麻醉后迅速固定置于Langendorff灌注管口。用37 ℃預先氧平衡的K-H液心臟逆行灌注(灌注壓力75-85 mmHg)，將帶有乳膠水囊的測壓管經二尖瓣插入左心室，連接Powerlab/8SP生物機能試驗壓力換能器系統，調節水囊使左室舒張末壓為4-8 mmHg。上述步驟均在2 min內完成。離體心臟37 ℃的K-H液平衡灌注20 min，平衡后心率>250次/min、左室收縮壓>85 mmHg、室性早搏<2個/min，未達條件者舍棄。

2.2灌注方案 C組平衡20 min后，續灌70 min；M組平衡20 min, 灌注4 ℃St.Thomas停跳液10 mL/kg，常溫下缺血40 min，再次灌注37 ℃含氧的K-H液30 min；IPO組于再灌注前先開放10 s，缺血10 s，反復6次，時間為2 min，再次灌注37 ℃含氧的K-H液28 min；5-HD+IPO組于缺血后主動脈逆灌含5-HD(100 μmol/L)的K-H液持續5 min，余同IPO組，再灌注37 ℃的K-H液23 min。并分別于平衡末(the end of equilibrium,T1)與續灌末或再灌注末(the end of reperfusion,T2)取心肌標本行線粒體各項指標測定。

2.3線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)測定 心肌線粒體提取參照Yamaguchi等[6]的方法：于T1、T2取心臟標本后立即剪碎、勻漿、離心后，取沉淀，分散于適量分離液中。線粒體蛋白定量方法參照Bradford 蛋白濃度測定試劑盒說明書，用酶標儀測定A595，根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。參照Huang等[7]的方法進行MMP測定：測定介質預熱至37 ℃，取2 mL移至反應體系，調零；加入rhodamine 123至終濃度約50 nmol/L，測定其熒光強度，根據標準曲線，計算反應體系中rhodamine 123的總量；加入線粒體，終濃度為0.2 g/L，熒光強度穩定后，加入FCCP，膜電位消失，線粒體內rhodamine 123重回反應介質后穩定。根據Nerst方程：Δψ=-59.5lgXin/Xout(Xin和Xout分別為線粒體內、外的rhodamine 123濃度)可計算出MMP。

2.4線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)測定 依照Mueller等[8]方法：測定介質預熱至37 ℃，取2 mL移至反應體系，記錄30 min內的熒光強度變化，在不加入線粒體的條件下重復1次，作為背景熒光扣除，標準曲線采用在測定介質中加入已知量的H2O2繪制，根據標準曲線轉換為ROS含量，計算ROS的生成速率。

2.5線粒體呼吸功能測定 參考Roussel等[9]方法：反應液1 mL，溫度30 ℃。加入測定介質0.9 mL，平衡5 min，再加入0.05 mL線粒體，記錄氧耗曲線，加入底物，啟動2態呼吸，記錄1 min，再加入ADP，啟動3態呼吸，記錄氧分壓變化情況；全部ADP均磷酸化為ATP后，線粒體進入4態呼吸；最后加入FCCP終濃度100 nmol/L，進入氧化磷酸化解偶聯狀態。分別以蘋果酸/谷氨酸、琥珀酸以及維生素C/TMPD為底物，測定相應的氧耗速率，并計算線粒體活性常數呼吸控制比(respiration control ration, RCR)及磷氧比(P/O)。

3統計學處理

結 果

1MMP的變化

各組T1時點MMP無明顯差異。而在T2時點MMP均較T1顯著降低(P<0.05,P<0.01)；T2時點C組顯著高于其它3組(P<0.01)，IPO組明顯高于5-HD +IPO組與M組(P<0.05,P<0.01)，5-HD +IPO組高于M組(P<0.05)，見表1。

表1 各組心肌線粒體膜電位(MMP)的變化

2心肌線粒體ROS的變化

各組T1時點ROS無明顯差異。T2時點各組ROS均較T1時點明顯升高(P<0.05或P<0.01)，其中M組顯著高于其它3組(P<0.01)，而5-HD +IPO組高于IPO組和C組(P<0.05或P<0.01)，IPO組高于C組(P<0.01)，見表2。

表2 各組心肌線粒體ROS的變化

3線粒體呼吸功能的變化

各組T2時點線粒體呼吸功能均較T1時點明顯降低(P<0.05或P<0.01)，T2時點C組呼吸功能優于其它3組(P<0.05或P<0.01)，IPO組優于5-HD+IPO組與M組(P<0.05或P<0.01)，5-HD+IPO組優于M組(P<0.05或P<0.01)，見表3。

討 論

線粒體是細胞中非常重要的細胞器, 是真核生物能量代謝的中心。MMP 是由于線粒體內膜的質子泵將基質內質子泵入外室而形成的。MMP的穩定有利于維持線粒體的正常生理功能，是反映線粒體內膜通透性的最佳指標之一和衡量線粒體功能的一個重要指標，也是線粒體進行氧化磷酸化、產生ATP的先決條件。MMP的大小直接反映線粒體功能的變化，通過抑制MMP的下降，可阻止細胞凋亡的發生，即MMP的降低是細胞凋亡特異性改變[10]。本實驗結果顯示缺血后處理可穩定心肌MMP，保護線粒體的功能，減輕心肌的缺血再灌注損傷。

線粒體是細胞產生氧自由基的重要場所，正常生理條件下線粒體以98%的耗氧量用來制造ATP，其余2%的耗氧量卻用來產生ROS。線粒體呼吸鏈在產生ATP的同時，有少量氧接受單電子，產生ROS，呼吸鏈的復合體I和Ⅲ是產生ROS的主要位點[11]。缺血缺氧可使線粒體受損，并使呼吸鏈處于高還原狀態，再灌注使呼吸鏈電子爆發而產生大量ROS，并通過受損線粒體漏出，同時可使氧化磷酸化解偶聯、ATP合成減少。ROS的增多一方面可使線粒體膜磷脂、呼吸鏈蛋白產生氧化損傷，加重氧化磷酸化障礙，損害線粒體功能；另一方面漏出的ROS可攻擊細胞中其它成分，使細胞發生不可逆的損傷[12]。本研究結果顯示缺血后處理能夠減少再灌注末線粒體ROS的產生，減輕心肌的線粒體及缺血再灌注損傷，產生心肌保護作用。

表3 各組心肌線粒體呼吸功能的變化

線粒體氧化磷酸化是兩個緊密聯系的過程，氧化是底物脫氫或失電子的過程，磷酸化是指ADP與Pi結合生成ATP，氧化的能量用于ATP的合成。線粒體呼吸活性常用呼吸控制比(RCR)和磷氧比(P/O)表示。3態呼吸代表的是ADP對線粒體氧化呼吸的刺激效應，4態呼吸主要反映的是無ADP時呼吸鏈氧化功能，此時無ATP的合成，是一個無效氧耗過程。P/O指消耗氧與所消耗無機磷的比例，反映線粒體氧化磷酸化效率，RCR指3態呼吸速率與4態呼吸速率之比,兩者是評價線粒體完整性和氧化磷酸化偶聯程度的靈敏指標。本實驗4態呼吸各組之間比較沒有明顯差別，提示缺血再灌注主要損傷呼吸鏈的氧化磷酸化偶聯，即ATP的合成過程。3態呼吸和RCR下降說明ADP對呼吸鏈電子傳遞速率的刺激效應降低，反映氧化磷酸化在一定程度上的脫聯。本研究結果顯示，缺血后處理可能通過開放特異性mitoKATP通道，使線粒體內膜去極化，減輕線粒體內鈣超載[13]，對呼吸鏈復合物有一定保護作用，從而較好地保護了線粒體呼吸功能。

總之，缺血后處理通過維持MMP穩定、減少心肌線粒體ROS的產生、保護線粒體呼吸鏈及呼吸功能，產生心肌保護作用。該作用可能與缺血后處理激活mitoKATP通道有關，而mitoKATP阻斷劑5-HD僅能部分阻斷缺血后處理對心肌線粒體的保護作用，因此，還有其它因素共同參與了缺血后處理的心肌保護。

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Effectofischemicpost-conditioningonmyocardialmitochondrialfunctioninisolatedratheart

LIU Xing-kui, DUAN Zhong-xin, YU Tian

(DepartmentofAnesthesiology,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:xkliu@zmc.edu.cn)

AIM: To investigate the protective effect of ischemic post-conditioning on isolated rat myocardial mitochondrial function during ischemia/reperfusion, and to study the role of mitochondrial ATP-sensitive potassium channel(mitoKATP) in myocardial protection.METHODSSprague-Dawley male rats were randomized into 4 groups(n=8 in each group): control group(C), model group(M), ischemic post-conditioning group(IPO) and 5-hydroxydecanoate plus IPO group(5-HD+IPO). The hearts isolated from the SD rats were mounted on a Langendorff apparatus and started with a 20-minute perfusion for equilibration. In C group, the hearts went on perfusion for another 70 min after equilibration. In M group, 4 ℃ St. Thomas cardioplegic solution was administered prior to ischemia, followed by ischemia for 40-minute, and reperfusion for another 30 min. In IPO group, the hearts underwent 40-minute global ischemia after equilibration, then perfusion for 10 s and ischemia for another 10 s. The procedure was repeated 6 times before 28-minute reperfusion. In 5-HD+IPO group, the hearts were perfused with 5-HD(100 μmol/L in K-H solution) and treated as that in IPO group, then reperfusion for 23 min. The reactive oxygen species(ROS), mitochondrial membrane potential(MMP) and respiratory function of myocardial mitochondria were measured at the ends of equilibration and reperfusion.RESULTS(1) Compared with the data collected at the end of equilibrium, the MMP was obviously decreased at the end of reperfusion in all groups, The highest in C group. MMP in 5-HD+IPO group was markedly higher than that in IPO group and M group. MMP in IPO group was higher than that in M group.(2) In contrast to that at the end of equilibrium, ROS was obviously increased at the end of reperfusion in all groups. However, ROS was observably higher in M group than that in the other 3 groups, and ROS in 5-HD+IPO group was markedly higher than that in IPO group and C group. ROS in IPO group was higher than that in C group.(3) The respiratory function of mitochondria was obviously injured at the end of reperfusion in all groups. The arrangement of the mitochondrial respiratory function from the best to the worse was C group > IPO group > 5-HD+IPO group > M group.CONCLUSIONIschemic post-conditioning attenuates myocardial reperfusion injury by maintaining the stability of MMP, decreasing the generation of ROS and preserving the respiratory chain function of mitochondria. The mitoKATPantagonist 5-HD can not completely block the myocardial protective effect of ischemic post-conditioning. Myocardial protective effect of ischemic post-conditioning may achieve by activating mitoKATP, meanwhile the other factors may also take part in the myocardial protective processes.

Mitochondrial function; Ischemic postconditioning; Reperfusion injury; Myocardium

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-004

1000-4718(2011)02-0229-05

2010-06-25

2010-11-29

國家自然科學基金資助項目(No.30740044)；貴州省科技基金資助項目[No.(2007)2121號]

△通訊作者Tel:0852-8608567；E-mail：xkliu@zmc.edu.cn