3-硝基酪氨酸與糖尿病心肌病大鼠心肌細胞凋亡的關系研究

韋金儒, 張雅莉

(廣西醫科大學第五附屬醫院心血管內科 廣西 柳州 545006)

3-硝基酪氨酸與糖尿病心肌病大鼠心肌細胞凋亡的關系研究

韋金儒△, 張雅莉

(廣西醫科大學第五附屬醫院心血管內科 廣西 柳州 545006)

目的探討2型糖尿病大鼠心肌組織及血中3-硝基酪氨酸(3-NT)與糖尿病心肌病(DCM)心肌細胞凋亡的關系。方法選取8周齡雄性SD大鼠60只，將其隨機分為4組，空白對照組、DCM組、糖尿病+纈沙坦處理組和DCM+纈沙坦處理組，每組15只。用TUNEL法檢測DCM心肌細胞的凋亡指數(AI)；用免疫組化的方法檢測心肌組織中3-NT的表達指數(EI)；用ELISA法檢測血清中3-NT的濃度。結果(1)4組大鼠的心臟重量指數有顯著差異(P<0.01)，DCM組和DCM+纈沙坦處理組心臟重量指數大于空白對照組和糖尿病+纈沙坦處理組。 (2)心肌組織免疫組化方法檢測表明，心肌組織中3-NT的EI與心肌細胞的AI呈正相關(P<0.01)，而血中3-NT的含量與心肌細胞的AI無相關關系(P>0.05)。(3)4組大鼠間的AI比較有顯著差異(P<0.01)。兩兩比較各組AI，DCM組>糖尿病+纈沙坦預處理組、DCM+纈沙坦處理組>空白對照組。(4)4組大鼠心肌組織3-NT表達指數比較有顯著差異(P<0.01)；兩兩比較，DCM組顯著大于其它3組。(5)4組大鼠血中3- NT的濃度比較無顯著差異(P>0.05)。結論(1)DCM大鼠心肌組織中3-NT的表達顯著增多并與心肌細胞凋亡密切相關，纈沙坦能夠抑制DCM大鼠心肌細胞中3-NT的表達，并由此抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡。(2)循環血中的3-NT水平不能真實反映DCM大鼠心肌組織中3-NT表達水平及其對心肌細胞凋亡的影響。

3-硝基酪氨酸; 糖尿病心肌病; 細胞凋亡

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是一種獨立性疾病，不同于高血壓、冠心病及其它原因心臟疾病的病理生理改變。最新研究[1,2]證實DCM是心肌對糖尿病的急性反應而導致的慢性病理改變，這些急性反應包括基因表達異常、信號轉導改變及細胞凋亡。 高血糖及其引起的代謝改變可導致血管內膜發生一系列級聯反應，包括炎癥因子釋放、單核細胞的趨化滲入和血管緊張素Ⅱ增多；血管緊張素Ⅱ可激活血管緊張素Ⅱ受體(angiotensin Ⅱ receptor) AT1和AT2，通過氧化應激，誘導心臟的炎癥反應，形成高毒性的過氧亞硝酸(peroxynitrite，ONOO-)。ONOO-可迅速使游離酪氨酸或蛋白質酪氨酸硝基化，形成穩定的終末代謝物3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)，從而導致心肌細胞線粒體功能障礙。本實驗目的在于探討2型糖尿病大鼠心肌組織及血中3-NT與DCM心肌細胞凋亡的關系。

材 料 和 方 法

1材料

鏈脲佐菌素為Sigma產品。鏈脲佐菌素溶液的配制：(1)檸檬酸2.1 g加入雙蒸水100 mL中配成A液；(2)檸檬酸鈉2.94 g加入雙蒸水100 mL中配成B液；(3)用時將A、B液按一定比例混合(1∶1.32)，pH計測定pH值,調節pH=4.2-4.5,即是配制鏈脲佐菌素所需的檸檬酸緩沖液；(4)鏈脲佐菌素以1%的濃度溶解于上述檸檬酸緩沖液中。3-NTⅠ抗為Abcam產品。TUNEL試劑盒為Roche原裝產品。大鼠3-NT ELISA kit為武漢中美科技產品。顯色劑購自南寧市桂海生物科技有限公司。血糖測定采用測利得VAC0037941型血糖儀,臺灣厚美德生物科技股份有限公司生產。纈沙坦膠囊，規格：80 mg；天大藥業珠海有限公司生產。

2方法

2.1實驗對象 選取健康清潔級8周齡的雄性SD大鼠60只(體重約180 - 220 g)，飼養于廣西醫科大學動物實驗中心, 飼養條件和實驗過程處理符合國家《實驗動物管理條例》。

2.2動物模型制作 將大鼠用高脂高糖飼料(豬油10%，蔗糖10 %，蛋黃5 %，基礎飼料75 %)喂養4周后，禁食不禁水過夜12 h，腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素的檸檬酸緩沖液一次，正常對照組用檸檬酸緩沖液腹腔注射；繼續高脂高糖飼料喂養4周后尾靜脈取血測血糖值，若隨機血糖≥16.7 mmol/L[3]且尿量和飲水量明顯增多，則列入2型糖尿病大鼠模型。繼續高脂高糖飼料喂養4周后，隨機取其中5只大鼠斷頸、摘除心臟，測量心臟重量指數(心臟濕重/大鼠體重)明顯增加，同時心肌組織切片病理檢查提示心肌病變(心肌細胞不同程度變性、壞死，心肌細胞間成纖維細胞增生，膠原纖維增加，細胞排列紊亂)，則DCM動物模型成立。

2.3分組 采用完全隨機對照試驗方法，將大鼠分為以下4組，每組15只。(1)空白對照組(N組)：SD大鼠15只，喂以常規飼料，用等量蒸餾水灌胃對照。(2)糖尿病+纈沙坦處理組(D+V組)：2型糖尿病大鼠15只，常規飼料喂養，纈沙坦40 mg·kg-1·d-1，加等量蒸餾水每天灌喂一次。(3)糖尿病心肌病組(DCM組)：15只大鼠，建立DCM模型成功后，給予常規飼料喂養，等量蒸餾水灌胃。(4)糖尿病心肌病+纈沙坦處理組(DCM+V組)：DCM大鼠15只，給予常規飼料喂養，纈沙坦40 mg·kg-1·d-1加等量蒸餾水每天灌喂一次，4周后收集標本。

2.4標本收集 各組大鼠斷頸后迅速開胸，于主動脈取血3 mL后，快速摘取心臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，行病理學、免疫組化檢測。同時將每份采集的全血高速離心后取上層血清，置-70 ℃冰箱保存，準備行ELISA檢測。

2.5病理學檢查 取出經4%多聚甲醛固定的心臟組織，進行大體觀測后取左心室心肌組織，常規脫水、包埋、切片、烤干，石蠟切片行HE染色。光鏡觀察心肌細胞改變。

2.6心肌細胞凋亡指數(apoptosis index, AI)的測定 用TUNEL法測定心肌細胞凋亡情況，在光鏡下觀察，以細胞核呈棕黃色為凋亡陽性細胞。隨機計數無重疊具有代表性的5個400倍視野，以平均每100個細胞核中含細胞凋亡個數作為AI[4]。

2.7心肌組織中3-NT表達指數(expression index，EI)的測定 用免疫組化法檢測心肌組織中3-NT，用Olympus CHC-212型數碼顯微鏡和Mtic Images Advanced 3.2系統進行圖像采集分析，于高倍鏡(×400)下測定各陽性片著色的平均吸光度(mean absorbance，MA)和陽性表達面積率(陽性表達面積占視野中核總面積的百分率，area%)，按公式EI = MA×area%×100[5]計算心肌組織中3-NT的EI。

2.8血清3-NT濃度測定 用ELISA方法檢測血清3-NT的濃度，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(A值)，通過標準曲線計算3-NT濃度。

3統計學處理

結 果

1實驗動物情況

全部實驗過程中SD大鼠，死亡7只，3只未納入模型標準。其中D+V組3只制模時死亡；DCM組2只制模時死亡；DCM+V組1只制模時死亡，1只在灌胃期間死亡,未納入模型標準3只。死亡原因可能為感染、糖尿病酮癥酸中毒或其他糖尿病并發癥。共有50只大鼠完成實驗:N組15只，DCM組13只，D+V組12只，DCM+V組10只。

2一般指標

糖尿病大鼠較N組大鼠明顯消瘦，尿量顯著增加，而且行動遲緩，飲水量增多，為N組的2.5倍，毛發雜亂、色晦暗、無光澤，血糖值維持在>16.7 mmol/L。N組大鼠血糖值維持在正常水平(<6.0 mmol/L)。

將4組大鼠的心臟濕重/體重比值進行方差分析，組間比較差異顯著(P<0.01)；進一步行兩兩比較，DCM組和DCM+V組的心臟重量指數較N組和D+V組明顯增加, 兩組間比較差異顯著，P<0.01,見表1。

表1 心臟重量指數的結果

3組織病理學改變和纈沙坦對心肌細胞凋亡的影響

顯微鏡下可見N組心肌細胞排列整齊，細胞核大小均一，胞漿染色均勻，內膜完整。DCM組心肌細胞不同程度的變性、壞死，心肌細胞間成纖維細胞增生，膠原纖維增加，細胞排列紊亂，見圖1。

Figure 1. HE stained sections of hearts in rats(×400).A:normal group;B: DCM group.

TUNEL法對心肌細胞凋亡進行測定，在光鏡下觀察觀察到，DCM組心肌細胞核呈棕黃色的凋亡陽性細胞數目顯著增多。4組大鼠組間心肌細胞凋亡指數比較有顯著差異(P<0.01)。心肌細胞AI兩兩比較顯示： DCM組>D+V組、DCM+V組>N組，見表2、圖2。

各組EI與AI呈顯著正相關，4組均為P<0.01，見表3。

表2 各組心肌細胞凋亡指數比較

Figure 2. TUNEL assay results of myocardial apoptosis(× 400).A:normal group;B:DCM group;C:D+V group;D:DCM+V group.

表3 心肌組織3-NT的EI和心肌細胞AI的相關分析

4組大鼠組間EI比較有顯著差異(P<0.01)。兩兩比較結果：DCM組EI顯著大于其它3組，見表4。組織學表現為DCM大鼠心肌細胞的胞漿出現強陽性反應，呈黃褐色；D+V組、DCM+V組2組大鼠心肌細胞的胞漿出現弱陽性反應，呈淺褐色；N組大鼠心肌細胞的胞漿出現陰性反應，呈背景淺藍色,見圖3。

4血中3-NT的濃度和心肌細胞AI的相關分析

用Cvxpt 14.0曲線分析軟件計算出標準曲線的直線回歸方程式為Y=6.5842+X。4組大鼠血中3-NT的濃度、心肌細胞AI及兩者相關系數見表5，4組中兩者均無顯著相關性，P>0.05。4組間血中3-NT水平比較無顯著差異(P>0.05)。

Figure 3. Immunohistochemical detection of 3-NT in myocardial cells(×400).A:normal;B:DCM group;C:D+V group;D:DCM+V group.

表4 各組EI比較

討 論

1972 年，Rubler等[6]在無明顯冠狀動脈粥樣硬化的糖尿病患者中觀察到一種特異性心肌病。隨后Hamby 等[7]通過進一步病理研究，首次提出了DCM的概念，并認為DCM與糖尿病特有的代謝有關。2000年有學者報道,糖尿病患者心肌中有較高數量的心肌細胞死亡現象,糖尿病患者如合并高血壓、心肌細胞死亡的現象更為明顯。

表5 血清3-NT濃度和心肌細胞AI的相關分析

本研究DCM造模結果證實：DCM大鼠心臟較N組明顯增大，DCM大鼠經纈沙坦治療后，摘除大鼠心臟發現心臟仍明顯擴大，心臟重量指數也明顯增加。本研究造模時間12周，冠狀動脈嚴重狹窄引起的心肌缺血和心室負荷增加導致心臟擴大的現象并沒有被觀察到。顯微鏡下觀察到無DCM大鼠細胞排列整齊，細胞核大小均一，胞漿染色均勻，內膜完整。而DCM組心肌細胞不同程度的變性、壞死，心肌細胞間成纖維細胞增生，膠原纖維增加，細胞排列紊亂。很顯然，這些病理性改變就是心臟擴大和心臟重量指數增加的原因，是心肌組織對糖尿病的早期綜合性反應，并且是DCM晚期并發心功能不全的根本原因。高血糖是這些病理改變的始動因素，但它通過何種機制導致了心肌細胞的變性、壞死和心肌間隙纖維化的發生和發展？本研究實驗結果表明:DCM組、D+V組和DCM+V組心肌細胞凋亡指數均顯著高于N組，表明心肌細胞凋亡和心肌細胞變性、壞死、心肌間隙纖維化密切相關。

Ceriello等[8]研究觀察到，在高血糖環境下，血管內皮細胞會產生過多的游離基，并伴隨細胞內3-NT、膠原蛋白和纖維連接蛋白顯著增多和PKC-β、NAD(P)H氧化酶及Bax的活化。即使在高血糖變成血糖控制良好的實驗性糖尿病大鼠，如經歷2個月血糖控制不良后再控制良好，雖然可以減少相關脂質過氧化物和氮硝氧化物的合成約50%，但在硝基酪氨酸形成仍然高于對照組80%[9]。本研究中心肌細胞中也有類似改變，在DCM組、D+V組和DCM+V組的心肌組織中3-NT表達含量都呈不同程度的顯著增加，各組3-NT表達指數均顯著高于N組，而且各組3-NT表達指數均與心肌細胞凋亡指數呈正相關，表明3-NT增多是心肌細胞凋亡的重要原因，氧化應激是細胞凋亡、心肌細胞壞死和纖維化重要途徑。目前認為，高血糖導致血管緊張素Ⅱ誘發的氧化應激加強，氧化應激產物3-NT在糖尿病心肌病大鼠心肌細胞內的表達可能啟動了線粒體死亡通路、膜受體死亡通路，參與并激活caspase和細胞凋亡中bcl-2基因的表達，進而導致心肌細胞凋亡。酪氨酸硝基化作為一種蛋白質翻譯后的修飾，常常在氧化應激下伴隨活性氧和活性氮的增加而產生。Turko等[10]提出3-NT的生成途徑包括ONOO-依賴途徑和非ONOO-依賴途徑，各途徑均使蛋白質酪氨酸殘基或游離酪氨酸發生硝基化反應，形成最終產物3-NT。蛋白質硝基化后能誘導酶活性的喪失、細胞的死亡和凋亡。

目前越來越多的證據[11,12]表明,血管緊張素Ⅱ是RAS系統中的關鍵效應分子,能誘導血管壁和心臟的炎癥反應。血管緊張素Ⅱ激活受體 AT1和AT2,進而通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化酶途徑產生過多的氧自由基或氮自由基,導致氧化應激、心肌細胞死亡和炎癥反應。Cai 等[13]利用轉基因糖尿病小鼠模型系統地證明了在糖尿病早期,高血糖可誘導心臟產生過多的氧或氮自由基,并降低心肌抗氧化損傷的能力,使心肌中氧化與抗氧化平衡失調,從而導致心肌細胞線粒體功能障礙,導致心肌細胞死亡。當心肌細胞死亡達到一定數量時,心臟組織結構和心肌功能就會發生改變。

本實驗經血管緊張素Ⅱ受體抑制劑纈沙坦干預后，D+V組和DCM+V組3-NT在心肌組織中的表達指數均較DCM組減少，同時心肌細胞凋亡的數目也明顯減少,表明纈沙坦能夠抑制心肌組織3-NT的表達和3-NT誘導的心肌細胞凋亡。這也反過來證實3-NT參與了氧化損傷在DCM發病中的關鍵性作用，抑制血管緊張素Ⅱ受體途徑就能夠抑制高血糖引起的氧化應激作用，阻斷心肌組織3-NT的生成，減少心肌細胞凋亡。然而，本實驗也觀察到，纈沙坦雖然可以抑制心肌組織3-NT的表達和心肌細胞的凋亡，但大鼠心臟仍明顯擴大，心臟重量指數也明顯增加，表明：心肌細胞壞死不是DCM的唯一發病機制，單純抑制心肌細胞中3-NT的表達可以減少心肌細胞的凋亡，但不能完全抑制心臟擴大。因為，糖尿病狀態下，由膠原、非膠原糖蛋白和蛋白聚糖組成的心肌細胞外基質的大量增生和降解異常，也是導致心肌收縮和舒張功能障礙、心臟擴大的另外原因[14]。因此，進一步探討3-NT對心肌間質纖維化的影響機制、尋找抑制心肌間質纖維化的途徑，將對DCM的進一步研究產生積極意義。

Antonio等[15,16]證明在2型糖尿病人群中，血漿硝基酪氨酸水平與血糖濃度呈正相關，餐后高血糖現象也與酪氨酸硝基化現象伴隨出現。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑依貝沙坦可以降低糖尿病患者血漿3-硝基酪氨酸水平，并且能在急性高血糖狀態下有效地對抗3-NT的形成。本實驗結果與此相反，4組大鼠間血中3-NT的水平無顯著差異，而且血中3-NT水平與DCM心肌細胞凋亡的指數無相關關系;經纈沙坦干預后血中3-NT含量對DCM心肌細胞凋亡數目未見影響。

總之，本研究結果表明：(1)DCM大鼠心肌組織中3-NT的表達顯著增多并與心肌細胞凋亡密切相關，纈沙坦能夠抑制DCM大鼠心肌細胞中3-NT的表達，并由此抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡；(2)循環血中的3-NT水平不能真實反映DCM大鼠心肌組織中3-NT表達水平及其對心肌細胞凋亡的影響；(3)盡管纈沙坦抑制了心肌組織中3-NT誘導的心肌細胞凋亡，但對心臟擴大無明顯改善，表明心肌細胞凋亡不是糖尿病心肌病大鼠心臟擴大的唯一發病機制。

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Relationshipbetween3-nitrotyrosineandmyocardialcellapoptosisinratdiabeticcardiomyopathy

WEI Jin-ru, ZHANG Ya-li

(DepartmentofCardiovascularmedicine,TheFifthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Liuzhou545006,China.E-mail:Drweijinru@yahoo.com.cn)

AIM: AIM: To explore the relationship between 3-nitrotyrosine(3-NT) level in hearts or blood and myocardial cell apoptosis in rat diabetic cardiomyopathy(DCM).METHODSSixty Sprague-Dawley(SD) rats(male, 8-week-old) were randomly divided into 4 groups: normal group, diabetic cardiomyopathy group(DCM group), diabetic rats treated with valsartan(40 mg·kg-1·d-1, D+V group) and DCM rats treated with valsartan(40 mg·kg-1·d-1, DCM+V group). Apoptotic index(AI) of rat cardiac myocytes was examined by TUNEL. The expression index(EI) of 3-NT in rat cardiac myocytes was examined by immunohistochemistry. The 3-NT concentration in rat serum was examined by ELISA.RESULTS(1) Significant differences of the heart weight indexes among the 4 groups were observed(P<0.01). The heart weight indexes in DCM group and DCM+V group were higher than those in normal group and D+V group(P<0.01).(2) The EI of 3-NT in the cardiac myocytes was positively correlated with the AI of the cardiac myocytes in the same group(P<0.01), but the concentration of 3-NT in blood had no correlation with the AI of cardiac myocytes(P>0.05).(3) The difference of AI of cardiac myocytes among the 4 groups had statistical significance(P<0.01). The arrangement from high to low of AI was DCM group > D+V group and DCM+V group > N group(P<0.05).(4) The EI of 3-NT in DCM group was the highest as compared to other groups(P<0.05).(5) No statistical difference of 3-NT concentration in blood among the 4 groups was observed(P>0.05).CONCLUSION(1) The expression of 3-NT in DCM myocardial tissues in SD rats is significantly increased and closely correlated with the apoptosis in myocardial cells. Valsartan inhibits 3-NT expression in DCM myocardial cells, thus inhibits the DCM myocardium apoptosis.(2) The 3-NT level in blood can not be true for reflection of 3-NT expression in DCM myocardial tissues and its effect on myocardial cell apoptosis.

3-Nitrotyrosine; Diabetic cardiomyopathies; Apoptosis

R5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-007

1000-4718(2011)02-0243-06

2010-05-28

2010-12-15

△通訊作者 Tel: 0772-2662012;E-mail:Drweijinru@yahoo.com.cn