漿細胞CD45和CD31的表達與多發性骨髓瘤細胞分化程度的關系*

歐陽涓， 李俊勛， 劉 茵， 吳培煌

(中山大學附屬第一醫院檢驗醫學部， 廣東 廣州 510080)

漿細胞CD45和CD31的表達與多發性骨髓瘤細胞分化程度的關系*

歐陽涓， 李俊勛△， 劉 茵， 吳培煌

(中山大學附屬第一醫院檢驗醫學部， 廣東 廣州 510080)

目的了解反映多發性骨髓瘤(MM)細胞生物學行為的免疫標記在骨髓不同階段漿細胞中的表達情況,為臨床調整治療策略和判斷疾病病程及預后提供依據。方法用流式細胞術檢測MM患者及對照組漿細胞表面相關分化抗原的表達情況，分析其在良、惡性漿細胞表達的差異，及其與原始漿細胞比例的相關性。結果MM患者漿細胞CD45和CD31表達率低于對照組漿細胞； MM細胞 CD45和CD31的表達率與原始漿細胞比例呈負相關；CD45表達與CD31表達呈現正相關。結論漿細胞CD45和CD31的表達率與MM細胞的分化程度呈正相關，其表達可能與MM的疾病進展有一定關系。

多發性骨髓瘤; CD45; CD31; 流式細胞術

多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種單克隆漿細胞惡性增殖性疾病，也是血液系統常見的惡性腫瘤。隨著我國人口老齡化，MM發病率也有逐年增高的趨勢。MM臨床表現多樣且不同，患者生存期相差很大[1,2]，從幾個月到10多年不等。研究表明抗原分子表達不同的各MM細胞亞群，其增殖能力和分化潛能也迥異，從而臨床表現也各不相同,因此研究反映MM細胞生物學行為的免疫標記,有助于調整治療策略和判斷疾病病程及預后[3,4]。CD45是單鏈跨膜糖蛋白，屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員，廣泛存在于造血系細胞表面。國外有研究表明CD45抗原的表達是MM的一個獨立預后指標，CD45陰性組較CD45陽性組生存期顯著縮短[5]，但不同分化階段的MM細胞及漿細胞CD45表達情況未有深入的研究。CD31，又稱血小板內皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1),屬于免疫球蛋白超基因家族，是存在于正常漿細胞上的少數幾個抗原之一，是CD38的配體，正常漿細胞均為CD31陽性。而國外有個別文獻[6]發現，免疫組化染色切片中，MM細胞不表達CD31，但未詳細闡明其表達情況與患者的病情進展及相關預后指標之間的關系。本研究采用流式細胞術分析MM患者的免疫表型，初步探討CD45和CD31在MM患者的表達情況，并分析其與MM細胞分化及其它黏附分子的相關性。

材 料 和 方 法

1病例選擇

從2009年5月-2009年8月于中山大學附屬第一醫院確診的MM患者16例，中位年齡57歲，均為初診，均為IgG型，其中男性7例，女性9例。另選同期骨髓漿細胞增多而細胞形態正常的患者9例作對照。

2標本采集

所有患者行骨髓穿刺術，抽取骨髓2 mL，EDTA抗凝。

3流式細胞術

按比例分別加入CD38-FITC、CD45-APC、CD56-PE、CD19-PerCP-cy5.5、CD20-PE-cy7、CD54-PE、CD138-PerCP-cy5.5、CD31-PE及各標記物同型對照，避光孵育20 min。每管加溶血劑1.0 mL，避光10 min后，洗滌后棄上清，用PBS 500 μL懸浮上機。用BD FACS Canto流式細胞儀及BD FACSDiva軟件獲取7×104細胞，CD45/CD38設門分析骨髓漿細胞各種抗原的表達。CD31抗體克隆號為WM59，購自eBioscience，其余抗體均購自BD。CD45表達的評估參照文獻[5]，cMFIPC=MFIPC×100/MFILYM，余各指標均以表達比例大于20%作為陽性標準。

4骨髓細胞形態學檢查

取MM患者及對照組骨髓液制作涂片，瑞氏染色，計數200個漿細胞，按照形態特點分成原始、幼稚和成熟3類。所有骨髓涂片鏡檢工作由同一檢驗醫師完成，并交另一檢驗醫師復核后發報。

5統計學處理

以SPSS 13.0分析數據。MM細胞CD31和CD45表達與原始、幼稚MM細胞比例及其它黏附分子表達關系采用Spearman非參數相關分析法；MM患者與對照組CD31和CD45表達比較采用秩和檢驗方法。

結 果

1骨髓瘤細胞CD45及CD31表達比例

如圖1所示MM患者組CD45表達最低為0.15，最高為2.5，對照組漿細胞CD45表達最低為9.2，最高14.25；MM患者組CD31表達最低為48.3%，最高為99.8%；對照組漿細胞CD31表達最低96.2%最高100%。采用秩和檢驗，發現MM細胞和對照組漿細胞在CD45及CD31的表達上有顯著差異(P<0.05)。

Figure 1. Expression of CD45 and CD31.Fluorescence analysis was performed on gated cells(P1), gated by CD38/CD45. A: strong expression of CD45 in the plasma cells of control group;B: strong expression of CD45 in the plasma cells of MM group;C: relatively weak expression of CD45 in the plasma cells of MM group; D, E,F: the isotype controls; G,H,I: the expression of CD31;D, G: the isotype control and the expression of CD31 of control group, CD31 expression is strong;E,H: the isotype control and the expression of CD31 of MM group, CD31 expression is strong; F,I: the isotype control and the expression of CD31 of MM group, CD31 expression is relatively weak.

2原始漿細胞比例與骨髓瘤細胞表面CD45及CD31表達比例相關性分析

骨髓瘤細胞表面CD45及CD31的表達比例和原始漿細胞比例有較好的負相關性，Spearman相關分析顯示，相關系數分別為r=-0.868及r=-0.864，呈顯著相關，P<0.01,見圖2。

3骨髓瘤細胞表面CD45與CD31表達相關性分析

CD31與CD45的表達呈顯著正相關(相關系數r=0.817，P<0.01)，見圖2。

Figure 2. Correlation analysis of the percentage of plasmablast in bone marrow and the expression of CD45 and CD31.A: morphology of the plasma cells in the bone marrow of control group. The percentage of plasma cells increased,and all of the plasma cells are mature. The expression of CD45 and CD31 is strong. B: morphology of the plasma cells in the bone marrow of MM patient group. The percentage of plasma cells increased, and the percentage of plasmablast is 0%. The expression of CD45 and CD31 is strong. C: morphology of the plasma cells in the bone marrow of MM patient group. The percentage of plasma cells increased, and most of the plasma cells are plasmablast. The expression of CD45 and CD31 is comparatively weak. D: correlation analysis of the percentage of plasmablast and the expression of CD45. Spearman correlation analysis, r=-0.868，P<0.01. E: correlation analysis of the percentage of plasmablast and the expression of CD31. Spearman correlation analysis,r=-0.864，P<0.01. F: correlation analysis of the expression of CD45 and CD31. Spearman correlation analysis, r=0.817, P<0.01.

討 論

流式細胞術對MM進行免疫分型，能夠準確、客觀地反映漿細胞的抗原分子表達，為鑒別良、惡性漿細胞、評估病情提供依據，因而廣泛應用于臨床MM檢測中。傳統的CD45/SSC設門檢測MM免疫表型，MM細胞與有核紅細胞不易區分，特別是在MM細胞比例低時，不能準確分析MM細胞的抗原表達。CD38/SSC也是常用的檢測MM免疫表型的方法，但由于CD38抗原除了表達在漿細胞外，在激活的T細胞、B細胞、造血祖細胞上也有表達，因此這種設門方法也會使MM細胞抗原檢測受到這些細胞的干擾。本研究采用CD45/CD38設門策略對MM進行免疫分型，提高了對克隆性細胞群的識別，這種設門方法也是國際上分析MM細胞廣泛應用的設門方法[7]。

漿細胞是B細胞分化發育的終末階段，在B細胞向漿細胞分化的過程中，許多B細胞分化抗原丟失，目前多認為正常漿細胞的免疫表型為CD38+CD138+CD54+CD20+CD19+CD56-，MM細胞的免疫表型為CD38+CD138+CD54+CD19-CD56+/-CD20+/-[8，9]，與本研究一致。同時本研究還發現MM細胞與腫瘤生物學行為相關的抗原表達具有異質性的特點，特別體現在CD45和CD31的表達上：從實驗數據來看，MM患者漿細胞CD45和CD31表達率低于對照組漿細胞，且原始MM細胞的CD45和CD31表達率低于分化較成熟的MM細胞。在CD31在表達強度上，我們與報道存在一定差異：Govender等[10]研究也發現，30例患者的良性或反應性漿細胞均為CD31陽性，而20例MM患者無論自骨髓或髓外取材，其漿細胞均不表達CD31分子。而本研究結果顯示，盡管MM細胞CD31相對低表達，但并未消失。分析本研究與前人研究存在差異的原因可能有：(1)病例：國人與西方人群可能存在人群差異，病人的年齡、性別及疾病嚴重程度也可能引起差異；(2)取材：骨髓取材部位的不一致可能導致明顯差異，彼實驗有自髓外取材，故有可能導致出現陰性結果；(3)儀器、方法：我們采用較為先進的六色流式細胞儀，通過CD45/CD38設門進行分析，靈敏度和特異性都很高，能較準確地反映CD31的表達情況。而Govender等[10]采用的免疫組織化學染色只對局部病變組織細胞進行染色檢查，檢測細胞數量有限，且靈敏度相對較低，對患者總體漿細胞CD31表達的反映能力與流式細胞分析有一定差異。

有研究表明，在MM細胞克隆內部，以CD45的表達分群，最能體現亞群之間生物學行為的區別[11]。CD45是B細胞活化的必要條件，也是免疫細胞上的一個關鍵的信號閾調節劑。我們知道IL-6是MM細胞重要的生長因子，正常漿細胞在IL-6的作用下不發生增殖，而MM細胞在IL-6的作用下發生增殖；IL-6誘導增殖需要Scr激酶的活化，而該酶的活化與CD45表達有關。因此在疾病早期MM細胞CD45的表達對于腫瘤增殖很重要。而關于MM腫瘤細胞生物學行為的研究[11]提示，CD45弱的MM細胞顯示一種更強的血管新生、髓外傳播和克隆生成能力，而且不易凋亡，是MM進展到疾病終末期的表現。CD31在MM的發病過程中也起到了重要作用。Vallario等[6]認為CD31和CD38的同質性及異質性結合與腫瘤惡性進展密切相關。而Tang等[12]的研究也發現腫瘤細胞的CD31參與介導了腫瘤細胞黏附于內皮細胞的過程。此外有研究表明，CD45強表達的MM細胞是IL-6的靶細胞，而有著高克隆生成能力的CD45弱表達細胞是IGF-1的靶細胞，因此更好地理解MM細胞CD45、CD31的表達有利于判斷疾病的進展情況以及臨床選擇相應的多層次的治療方法。

我們的研究還發現CD45和CD31的表達率與原始漿細胞比例呈負相關。Vallario等[6]也曾發現MM的CD31表達率與原始漿細胞有關。其將MM分為原始漿細胞型與成熟漿細胞型后，發現原始漿細胞型MM患者瘤細胞CD31陰性，而成熟漿細胞型則為陽性表達。但我們的實驗中只存在CD45、CD31相對低表達，并無陰性表達情況出現。較之將MM絕對的分為原始漿細胞型與成熟漿細胞型的方法，我們將CD45、CD31的表達比例與形態學中原始、幼稚細胞比例進行相關性分析的方法明顯更優。另外，盡管采用的單克隆抗體在克隆號和標記物均有差別，但由于本研究采用了同型對照等質量控制措施，出現明顯系統誤差的可能性較小。因而我們可以推斷，分化越差、形態越幼稚的漿細胞比例越高，意味著患者疾病進展越后期，患者的預后也越差。同時也可以提示，在沒有條件開展流式細胞分析的情況下，形態學檢測時MM細胞的成熟度對病程、預后的判斷有重要參考價值。

MM細胞黏附分子的相關分析中我們發現，CD45與CD31的表達呈正相關，提示CD45與CD31可能共同參與MM的疾病進展。已有文獻[13]證實血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)與CD45弱表達的MM細胞髓內血管生成關系密切。而我們也注意到以往一些研究腫瘤的文獻論及CD31時，也認為其與腫瘤的血管生成相關。Nelson等[14]和Harvey等[15]的研究揭示了CD31在某些腫瘤中介導血管生成的機制：血管內皮細胞通過出芽方式形成新的毛細血管，CD31表達使瘤細胞與內皮細胞或基質細胞黏附，促使基質金屬蛋白酶激活，同時細胞外基質和血管基膜被降解，從而使腫瘤新生血管出芽形成新的血管。從CD31生成血管機制來看，其和VEGF生成血管的相關性也很大。但在MM中CD31是否參與腫瘤新生血管，其與CD45是否存在協同作用尚待進一步研究。

我們知道，MM是B細胞起源的幼稚與成熟細胞構成的漿細胞異常增生惡性腫瘤，而本研究顯示原始漿細胞比例高的MM患者其CD45和CD31表達也相對較低，因而，我們推測可能是骨髓漿細胞惡變導致原始、幼稚漿細胞比例明顯升高，因而CD45和CD31表達下降，分化程度差的MM細胞CD45和CD31表達量下降，分化程度好的MM細胞CD45和CD31表達量則相對較高。這其中是否存在某種致病基因的調控表達，又或者還有其它影響CD45和CD31表達的因素，這些都需要進一步的實驗證明。同時也提示我們以后從分子生物學、細胞生物學以及遺傳學等方向更深層地研究CD45和CD31在MM疾病進展中的作用機制。

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ExpressionofCD45andCD31indifferentiationstagesofmultiplemyeloma

OUYANG Juan, LI Jun-xun, LIU Yin, Wu Pei-huang

(DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:abericc@tom.com)

AIM: To provide information of progression, prognosis and treatment strategy for multiple myeloma(MM) by determining the expression levels of CD45 and CD31 on plasma cells in different differentiation stages.METHODSThe expression levels of CD45 and CD31 in bone marrow plasma cells in MM patients were determined by the technique of six-color flow cytometry. The bone marrow plasma cells from the patients of bone marrow plastcytosis(the cell morphology was normal) were used as control. The correlated immunophenotyping data with the percentage of plasmablast were analyzed.RESULTSThe expression of CD45 and CD31 in MM group was lower than that in control group. In MM group, the expression of CD45 and CD31 on plasma cells was negatively correlated with the percentage of plasmablast, and the expression of CD45 was positively correlated with that of CD31.CONCLUSIONThe expression of CD45 and CD31 may be correlated with the differentiation stages of plasma cells, and is possibly associated with the progression of multiple myeloma.

Multiple myeloma; CD45; CD31; Flow cytometry

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-015

1000-4718(2011)02-0288-05

2010-05-31

2010-11-19

中山大學2009年學生暑期科研基金資助項目

△ 通訊作者 Tel：020-87755766-8462; E-mail: abericc@tom. com

白細胞介素-6和人角膜緣干細胞龕：上皮細胞和間質組織間相互作用的中介

有一種關于人角膜緣上皮(human limbal epithelial, HLE)更新和損傷后修復的假說認為：存在于基底部的角膜緣上皮干細胞(limbal epithelial stem cells, LESCs)維持著角膜緣上皮的正常更新和損傷后修復。由于不含血清的培養基可以模擬角膜緣龕內的微環境，英國科學家首次利用這種不含血清的培養基建立了體外培養模型來研究HLE細胞和有絲分裂活躍的角膜緣成纖維細胞之間的相互作用。將HLE細胞與角膜緣成纖維細胞以3∶1的比例聯合，可見干細胞標記物ABCG2和p63α表達增強，集落保存完整。用不含血清的，且HLE細胞與角膜緣成纖維細胞以3∶1比例混合培養體系(3.1SF)與加入成纖維細胞生長抑制劑和血清的HLE細胞培養體系(金標準培養體系)作比較，發現IL-6在3.1SF培養體系中表達上調。同時，IL-6誘導HLE細胞中的STAT3磷酸化呈時間依賴性，從而通過STAT3途徑來調節HLE細胞的集落形成。如果抑制3.1SF體系中STAT3和IL-6的表達，HLE細胞的集落形成效率就顯著降低。這表明LESC龕中的IL-6介導STAT3途徑可以維持HLE細胞保持其祖細胞樣表型及增殖能力。本研究通過設計了一個體外模型來探究與LESCs相關的細胞與細胞之間的相互作用，說明存在于LESCs龕結構基底的角膜緣上皮細胞和基質中的成纖維細胞之間有著緊密聯系的空間分布特征。

Stem Cell Res，2010, 5(3):188-200(李麗娜)