MicroRNA-9-1慢病毒載體的構建及其對小鼠骨髓間質干細胞誘導分化為神經細胞的影響*

景黎君， 賈永林， 魯晶晶， 韓 瑞， 王舒陽， 李盡義， 彭 濤， 賈延劼

(鄭州大學第一附屬醫院神經內科, 河南 鄭州 450052)

MicroRNA-9-1慢病毒載體的構建及其對小鼠骨髓間質干細胞誘導分化為神經細胞的影響*

景黎君， 賈永林， 魯晶晶， 韓 瑞， 王舒陽， 李盡義， 彭 濤， 賈延劼△

(鄭州大學第一附屬醫院神經內科, 河南 鄭州 450052)

目的探討microRNA-9-1在體外誘導小鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)向神經細胞分化中的作用。方法構建小鼠microRNA-9-1慢病毒載體(microRNA-9-1-LV)并感染小鼠MSCs，篩選最適感染復數(MOI)；實驗分為未感染組、感染組(感染microRNA-9-1-LV)、陰性對照組(感染FU-RNAi-NC-LV)；采用β-巰基乙醇誘導感染后小鼠MSCs分化為神經細胞。倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs感染后熒光表達情況；采用免疫細胞化學染色檢測神經元烯醇化酶(NSE)、神經微管結合蛋白(MAP-2)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達變化；PT-PCR檢測MAP-2 mRNA的表達變化；MTT方法檢測細胞存活率。結果(1)陽性克隆PCR證明小鼠microRNA-9-1慢病毒載體構建成功，孔稀釋法測定病毒滴度為1×1012TU/L。(2)倒置顯微鏡下觀察小鼠microRNA-9-1慢病毒載體感染成功，MOI值為20，感染4 d時感染率最高，細胞存活率較高，感染率可達 91.3%±4.2%。(3)β-巰基乙醇可以誘導MSCs向神經細胞分化，其中以感染組誘導效果最佳，NSE和MAP-2的表達率顯著高于其它各組(P<0.05)。結論(1)MicroRNA-9-1-LV可高效感染小鼠MSCs。(2) 感染miRNA-9-1-LV后MSCs經β-巰基乙醇誘導向神經細胞分化比率增加。

MicroRNA-9-1； 骨髓間充質干細胞； 神經元； 慢病毒

MicroRNA是生物體內源的小RNA分子，可以在轉錄水平、轉錄后水平、表觀遺傳學水平等水平調控基因組的表達，參與生命過程中一系列的重要進程[1]。誘導骨髓間質干細胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)分化為神經細胞有可能成為臨床中樞神經系統疾病治療的可行性方法[2]，但其具體機制尚不清楚，研究發現MSCs分化為神經細胞過程中，microRNA在其中起著重要調控作用[3]。microRNA-9在腦組織中表達較為豐富，研究表明，microRNA-9在神經干或前體細胞分化發育中起著重要作用[4]。MSCs可以向神經細胞方向分化，但是microRNA-9是否在MSCs誘導分化中起作用尚不清楚。本研究根據確定的microRNA-9-1序列，構建目的microRNA慢病毒載體，將其感染小鼠MSCs，β-巰基乙醇誘導各組細胞，觀察microRNA-9在小鼠MSCs橫向分化為神經細胞中作用。

材 料 和 方 法

1動物

SPF級BALB/c小鼠，雌雄不限，6-8周齡，18-20 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2005-0001。MSCs由小鼠股骨中分離提取，連續傳10代以上。293T細胞和大腸桿菌菌株DH5α由鄭州大學生物化學教研室惠贈。

2主要試劑

XbaI、HpaI及T4 DNA ligase購自NEB；RNA干擾載體pFU-GW-RNAi和病毒包裝三質粒：pGC-LV 重組載體(同時可表達綠色熒光蛋白)和pHelper 1.0和pHelper 2.0均購自上海吉凱基因化學有限公司；感染試劑Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；DMEM液體培養基和胎牛血清購自Gibco；神經元烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE H-300，sc-15343)、神經微管結合蛋白(microtubulin-associated protein 2, MAP-2,sc-20172)和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP H-50，sc-9065)兔抗多克隆抗體購自Santa Cruz；Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司；RNeasy Mini試劑盒和OneStep RT-PCR試劑盒均為Qiagen產品；凝聚胺、多聚賴氨酸和噻唑藍(MTT)購自Sigma；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由上海吉凱基因技術有限公司根據設計合成，見表1。

3主要方法

3.1MicroRNA-9-1慢病毒載體的構建 根據miRBase數據庫獲得microRNA-9-1(MI0000720)的序列，設計合適的引物序列， PCR方法合成含雙鏈DNA oligo，其兩端含酶切位點黏端。將pFU-GW-RNAi載體XbaⅠ和HpaⅠ雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下，與雙鏈DNA oligo于4 ℃ 12 h連接反應制備克隆連接液，轉化大腸桿菌感受態細胞后進行陽性克隆PCR鑒定。脂質體介導的瞬時感染方法進行慢病毒顆粒的包裝。感染前24 h，調整細胞293T 細胞密度為6×108cells/L，重新接種于15 cm2細胞培養皿，37 ℃、5% CO2培養箱內培養。待細胞密度達70%-80%時即可感染。DNA溶液(pGC-LV載體20 μg ，pHelper 1.0載體15 μg，pHelper 2.0載體10 μg)，與相應體積的Opti-MEM混合均勻，調整總體積為2.5 mL，加入離心管中，室溫下溫育5 min。取100 μL Lipofectamine 2000 試劑在另一離心管中與2.4 mL Opti-MEM混合，室溫下溫育5 min。然后將分別含有DNA和脂質體溶液混合,輕柔混勻,室溫下溫育20 min。將DNA與Lipofectamine 2000 混合液轉移至293T細胞的培養液中，混勻，于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。培養8 h后倒去含有感染混和物的培養基，每瓶細胞加入20 mL的PBS液，輕輕左右晃動培養瓶以洗滌殘余的感染混和物，然后倒去。每瓶細胞中加入含10% 血清的細胞培養基25 mL，于37 ℃、5% CO2培養箱內繼續培養48 h。收集感染后48 h的293T細胞上清液。于4 ℃、4 000×g離心10 min，除去細胞碎片。0.45 μm濾器過濾上清液于40 mL 超速離心管中，再離心濃縮病毒液至所需濃度。收集病毒液，分裝后-80 ℃長期保存。取其中1支用孔稀釋法進行病毒滴度測定。同樣方法制備僅含GFP報告基因的陰性對照慢病毒載體。

表1 引物序列

3.2感染復數(multiply of infection，MOI)值測定 取培養10代以上的小鼠MSCs，以2×109cells/L的密度接種至24孔板，培養2 d至細胞融合度達到30%-50%。分為5個不同梯度的MOI值。在完全培養基中加入含有microRNA-9-1和GFP(綠色熒光報告基因)的慢病毒載體上清，對照組B組加入僅含GFP的陰性對照慢病毒載體上清，兩組均加上終濃度為5 mg/L的凝聚胺(polybrene)。共感染24 h, 換新鮮培養基。感染后每天倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞GFP表達情況，并計數GFP陽性細胞的百分比。

3.3小鼠MSCs感染及實驗分組 取microRNA-9-1-LV以最適MOI值感染小鼠MSCs，同時，取同一MOI值的FU-RNAi-NC-LV感染陰性對照組置于37 ℃、5% CO2培養箱內孵育，孵育24-72 h。根據感染情況將同時點的MSCs細胞分為3組：未感染組：不進行感染，其它培養條件同各感染組；感染組：感染microRNA-9-1-LV，即含有microRNA-9-1病毒和GFP；陰性對照組：感染FU-RNAi-NC-LV，即只含有GFP。在倒置熒光顯微鏡下觀察感染后24 h、48 h、72 h、96 h GFP熒光表達情況，評價細胞感染效率。

3.4體外誘導MSCs分化為神經細胞 取各組細胞進行誘導實驗。去除DMEM完全培養基，D-Hank’s液清洗3次，加入預誘導液(DMEM培養基+10%胎牛血清+1 mmol/L β-巰基乙醇)置于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h。預誘導后，加入誘導液(DMEM培養基，5 mmol/L β-巰基乙醇)，37 ℃、5% CO2條件下培養5 h。

3.5MTT比色法 將感染microRNA-9-1-LV和FU-RNAi-NC-LV前后各時點的MSCs移入96孔培養板，加入MTT(5.0 g/L)50 μL/well、置入培養箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜200 μL，采用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度值，評價細胞存活率。

3.6免疫細胞化學染色法 將各組細胞用PBS清洗之后，迅速經4%多聚甲醛的固定液中于4 ℃固定過夜，0.2% Triton X-100處理10 min，并用封閉液封閉1 h。然后分別用NSE抗體(1.0 mg/L)、MAP-2抗體(1.0 mg/L)和GFAP抗體(1.0 mg/L)4 ℃孵育 24 h。用PBS 洗3遍后，用Cy3標記山羊抗兔IgG(1∶500)在室溫下進行染色標記、觀察。細胞圖像通過顯微鏡用 ×10或 ×20攝取。每組獨立的實驗都會采集超過30個區域的細胞。而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細胞數目。應用ImagePro Plus 6.0專業圖像分析軟件分析各實驗組的熒光圖片單個細胞的累積吸光度值，進行統計學分析。

3.7RT-PCR 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。參照OneStep RT-PCR試劑盒實驗操作說明進行RT-PCR，總反應體積50.0 μL，其中5×OneStep RT-PCR buffer 10.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2.0 μL，5×Q-solution 10.0 μL， RNase inhibitor 10U， RNA1.0 μg，引物 0.6 μmol/L。擴增條件為：50 ℃逆轉錄30 min, 95 ℃ 15 min, 94℃ 1 min, 55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min, 30-35個循環, 72 ℃ 10 min。然后，取RT-PCR產物10.0 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統拍攝保存實驗結果，凝膠圖像分析系統(GelPro Analyzer 3.0)分析各目的基因與β-actin基因條帶吸光度值。

4統計學處理

結 果

1miRNA-9-1慢病毒載體的構建

pFU-GW-RNAi載體經HpaⅠ 和XhoⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示載體中位于兩酶切位點間的原有片段被分離, 載體被切割成線性,見圖1。挑選陽性克隆送測序，陽性克隆測序結果，見圖1。證明大鼠miRNA-9-1慢病毒載體構建成功。慢病毒載體系統的3 個質粒pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper 2.0按一定比例共感染293T 細胞，收集感染后48 h的293T細胞上清液，進行離心濃縮。取濃縮的病毒液用孔稀釋法進行病毒滴度測定，T=1×1012TU/L(TU, transduction unit)。

Figure 1. PCR results for constructed microRNA-9-1-LV vector. A: enzyme-digested product. 1: marker; 2: the pFU-GW-RNAi plamsid without digested; 3: The pFU-GW-RNAi plamsid digested by XbaⅠ and HpaⅠ. B: PCR for cloned target gene. 1:the group with ddH2O; 2:the group with empty vector; 3:the group with GAPDH; 4: marker; 5-12:the groups with transformants of microRNA-9-1.

2MicroRNA-9-1慢病毒感染

本研究采用含有綠色熒光報告基因(GFP)標記的病毒載體觀察、評估感染效率。倒置熒光顯微鏡觀察感染24 h，可以觀察到部分綠色熒光，感染4 d時GFP表達最理想，感染組和陰性對照組GFP感染率沒有明顯差異，見圖2、表2。

Figure 2. The cell infection rate(48 h after transfection, ×200). A: transfected group; B: negative control group.

表2 細胞感染率

3MTT結果

感染前各組MSCs的MTT結果無顯著差異(P>0.05)；感染24 h，感染組MTT值顯著下降，與各對照組MTT比較均有顯著差異(P<0.05)，各對照組之間無顯著差異。感染48 h、72 h、96 h后MTT值雖較24 h有所上升(P<0.05)，但與其它組MTT比較仍有顯著差異(P<0.05)，見表3。

4β-巰基乙醇體外誘導MSCs分化為神經細胞

未感染組MSCs誘導5 h，部分細胞出現神經細胞改變，胞體收縮呈多角形或圓形，突起細長，有數個分支，部分在局部形成網絡。感染microRNA-9-1-LV組誘導后，細胞形態變化更為迅速和顯著，誘導5 h多數細胞胞體收縮呈圓形、錐形，細胞突起細長，交織成網，形成較典型的神經細胞結構，少量細胞脫落、死亡。陰性對照組和未感染組類似，見圖3。

表3 MSCs MTT 結果

Figure 3. β-ME induced MSCs into neurons(×200). A: transfected group; B: negative control group.

5免疫細胞化學染色法

感染組誘導5 h，NSE和MAP-2的表達率分別為 87.2%±2.0%和85.5%±0.8%，顯著高于其它各組(P<0.05)。各組GFAP表達率均小于1%，無顯著差異，見圖4、表4。

Figure 4. Expression of MAP-2 in β-ME-induced differentiation of MSCs into neurons(5h after induction, ×200). A:transfected group; B: negative control group.

表4 β-巰基乙醇誘導5 h各組細胞免疫化學染色結果

6RT-PCR結果

3組分別誘導分化5 h均表達MAP-2 mRNA，未轉然組和陰性對照組比無顯著差異，感染microRNA-9-1組表達MAP-2 mRNA較前2組明顯增高，差異顯著，見圖5、6。

Figure 5. The RT-PCR for MAP-2. A: transfected group；B: negative control group; C: non-transfected group.

Figure 6. MAP-2 mRNA expression.s.n=15.*P<0.05 vs other groups.

討 論

1慢病毒載體感染技術

慢病毒基因轉導載體包容量大，能夠感染任何類型神經細胞，其攜帶的目的基因可整合到宿主細胞基因組使外源基因獲得長期穩定表達，且不編碼病毒蛋白，在中樞神經系統中也不會引起免疫反應[5]。在人和小鼠腦組織中成熟的microRNA-9有3種不同形式，microRNA-9-1、-9-2和-9-3，其原始轉錄本分別位于3、13、7號染色體上。通過用維甲酸處理小鼠P19細胞發現，microRNA-9-1在誘導后有明顯變化，經歷急劇上升至迅速下降過程，且處理后神經特異性標志物MAP-2逐漸上升，提示microRNA-9-1在神經分化中起著重要調控作用和生物指示作用[6]。

據此本研究采用三質粒表達系統即pGC-LV載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體來構建慢病毒載體，建立microRNA-9-1增強體外模型，并探討其在MSCs誘導分化為神經細胞中的作用提供依據。

2MicroRNA-9在MSCs向神經細胞分化中的作用

MicroRNA可以作為發育開關以及微調發育程序來調控生物體內多種發育過程[7]。MicroRNA-9是腦組織特異表達的一種小RNA，它在小鼠胚胎干細胞和腫瘤細胞的分化中起重要調控作用[8]。研究發現，microRNA-9在神經干細胞向神經元分化過程中起重要調控作用[9]，通過影響轉錄激活因子STAT3信號通路來促進神經分化[5]，通過Fgf信號通路調控中腦后腦交接區(midbrain-hindbrain boundary,MHB)的組織活性[10]。 Krichevsky等[4]研究發現在胚胎發育的第5階段microRNA-9/9*表達較高，此階段是神經元前體向神經元和膠質細胞分化的關鍵時期，抑制神經前體細胞中microRNA-9表達可使神經元數量減少29%-31%。MicroRNA-9調控著由胚胎干細胞衍生來的神經祖細胞的增殖和遷移，由其直接調控的一個靶基因可以編碼一種19 kD的磷酸蛋白stathmin，該蛋白特異性在神經祖細胞上表達，可以增加微觀的不穩定性，從而促進細胞定向遷移[11,12]。本研究發現感染microRNA-9-1慢病毒載體的MSCs向神經細胞分化效率增加，考慮可能和microRNA-9的上述作用有關。

MSCs是一種成體干細胞，可以向骨、軟骨、脂肪等多種組織分化，研究發現還可以向神經細胞分化[13、14]。與神經干細胞定向分化所不同，MSCs分化為神經細胞是一種橫向分化方式，其調控因子目前了解較少。Greco等[3]發現在人MSCs分化為神經細胞過程中，microRNA在其中起著重要調控作用。但與神經干細胞分化機制是否相同，microRNA-9是否參與分化過程尚未見報道。本研究首次采用感染microRNA-9-1慢病毒載體，構建microRNA-9-1增強模型，觀察其在MSCs誘導分化中的作用。本研究發現，microRNA-9-1慢病毒載體可高效感染小鼠MSCs，感染后報告基因GFP可穩定表達。本研究MTT結果發現，感染microRNA-9-1慢病毒后，MSCs存活率下降，但感染僅含有報告基因的慢病毒載體后MSCs存活率變化不大，表明microRNA-9在MSCs保持細胞自我更新、分裂、凋亡等生理功能中起到一定作用。

本研究發現，與未感染和感染僅含有GFP的慢病毒的MSCs相比感染microRNA-9-1慢病毒后，MSCs向神經細胞分化效率顯著提高，神經細胞早、中期標志物NSE和成熟神經細胞特異性標志物MAP-2表達均明顯增高，且未見GFAP表達。這提示microRNA-9-1可能在MSCs橫向分化神經細胞中起作用，提高microRNA-9-1的表達，可以促進MSCs向神經細胞分化。發現單獨感染microRNA-9-1慢病毒并不能使MSCs向神經細胞分化，還必須在誘導劑(巰基乙醇等)的作用下才能分化。這說明microRNA-9-1在MSCs在橫向分化為神經細胞過程中不是唯一的，可能是對一些信號途徑調控，如Notch信號途徑[15]，從而提高誘導效率。但是具體機制尚不明確。

綜上所述，本研究采用慢病毒感染技術，建立microRNA-9-1過表達細胞模型，從而促進MSCs向神經細胞的分化效率，提示microRNA-9-1在MSCs誘導分化為神經細胞過程中可能起促進作用。

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EffectoflentiviralvectorofmicroRNA-9-1ondifferentiationofmousebonemarrowmesenchymalstemcellsintoneurons

JING Li-jun, JIA Yong-lin, LU Jing-jing, HAN Rui, WANG Shu-yang, LI Jin-yi, PENG Tao, JIA Yan-jie

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China.E-mail:jiayanjie1971@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the role of microRNA-9 in inducing bone marrow mesenchymal stem cell(MSCs) differentiation into neurons.METHODSThe lentiviral vector of microRNA-9-1(microRNA-9-1-LV) was constructed and transfected into mouse MSCs. The cells were divided into non-transfected group, transfected group(transfected with microRNA-9-1-LV) and negative control group(transfected with FU-RNAi-NC-LV). MSCs were treated with β-mercaptoethanol(β-ME) as an inducer for triggering the cells to differentiate into neurons. The fluorescence expressed by transfected MSCs were observed under inverted fluorescence microscope. The mRNA expression of microtublin-associated protein 2(MAP-2) was detected by RT-PCR. The expression of neuron-specific markers,neuron-specific enolase(NSE), MAP-2 and glial fibrillary acidic protein(GFAP), were measured by immunocytochemical method. The viability of MSCs was determined by MTT method.RESULTSThe results of PCR confirmed successful construction of mouse microRNA-9-1-LV. The virus titer was 1×1012TU/L(TU, transduction unit). The best transfection efficiency(up to 91.3%±4.2%) and survival rate appeared when multiply of infection(MOI)was 20 and on 4th day. β-ME induced MSCs to differentiate into neurons and the best efficiency of the induction was observed in transfected group. The expression levels of NSE and MAP-2 in transfected cells were higher than those in the cells of other group(P<0.05).CONCLUSIONMicroRNA-9-1-LV has high transfection efficiency in mouse MSCs. Higher differentiation rate from mouse MSCs to neurons is induced by β-ME after the cells are transfected with microRNA-9-1-LV.

MicroRNA-9-1; Marrow mesenchymal stem cells; Neurons; Lentivirus

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-022

1000-4718(2011)02-0326-06

2010-09-07

2010-11-09

國家自然科學基金資助項目(No.30770758)；河南省教育廳自然科學研究計劃資助項目(No.2008A320032)

△通訊作者 Tel：0371-66295112; E-mail:jiayanjie1971@yahoo.com.cn