白地霉分批發酵產脂肪酶動力學模型的建立

王 揮 袁 強，2 張 敏 黎繼烈 李忠海

白地霉分批發酵產脂肪酶動力學模型的建立

王 揮1袁 強1，2張 敏1黎繼烈1李忠海1

(中南林業科技大學生命科學與技術學院1，長沙 41004)
(湖南未名創林生物能源有限公司2，長沙 410004)

對脂肪酶產生菌白地霉PP1315在5 L自控發酵罐中的分批發酵進行了動力學分析。探討了PP1315在5 L罐分批發酵過程中菌體生長、脂肪酶合成及基質消耗的變化規律，結果表明，菌體生長呈典型S型曲線，酶的合成與菌體生長趨勢呈現部分相關性，屬于部分偶聯型。基于這些過程曲線的變化規律，結合Logistic方程和Luedeking－Piret方程，建立了脂肪酶產生菌PP1315分批發酵過程的動力學模型，并通過數學推導和非線性擬合獲得了模型中各參數的最佳取值，脂肪酶合成動力學模型的相關系數為R2=0．925，確定了能夠較好表征PP1315分批發酵過程中菌體生長、產物脂肪酶合成以及基質消耗的動力學方程。

脂肪酶 分批發酵 動力學模型 非線性擬合

脂肪酶(Lipase，EC3．1．1．3)是一類重要的甘油酯鍵水解酶，可以在油水界面上催化三酰甘油水解生成脂肪酸和甘油，以及中間產物甘油一酯和甘油二酯［1］。脂肪酶的產業化主要來源于微生物發酵［2］，目前工業上采用微生物發酵制備和提取脂肪酶應用于食品、醫藥、洗滌、皮革、造紙等行業［3］。近年來因其可催化各類化學選擇性、區域選擇性、立體結構選擇性轉化反應等特點，促使脂肪酶在有機合成中得到廣泛應用［4－5］。隨著礦化石油資源日益枯竭和人們生態環境保護意識的提高，使得脂肪酶催化合成生物柴油作為可再生替代環保燃料為世人矚目［6－8］。

采用微生物發酵產脂肪酶的過程具有多樣性、耦合性、時變性和非線性等特點，既包括了細胞內各種各樣的生化反應，也涉及細胞間各種物質交換的復雜體系［9］，由此可見對微生物發酵規模放大過程規律的研究，是發酵產品能否實現工業化生產的關鍵［10］。根據張敏［11］對白地霉 PP1315 搖瓶發酵的研究可知，白地霉PP1315發酵是一個比較復雜的過程，因此深入探討白地霉PP1315在發酵罐中的分批發酵條件和動力學特征，對于促進脂肪酶的規模化生產很有必要。本研究通過建立白地霉PP1315分批發酵動力學模型，旨在實現白地霉PP1315產脂肪酶的發酵過程優化控制，降低生產成本，為進一步放大試驗和連續發酵提供理論基礎。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑與儀器

白地霉(Geotrichum candidum)PP1315:由本課題組經多次誘變選育并保藏于發酵工程實驗室。

斜面培養基:麥芽糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂粉15 g/L。

種子培養基:葡萄糖2．0 g/L，蛋白胨 2．5 g/L，K2HPO40．1 g/L，橄欖油1．0 mL/L。

發酵培養基:玉米粉15 g/L，豆餅粉10 g/L，橄欖油 10 ml/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 1．5 g/L。

B型SL 5 L全自動控制發酵罐:上海保興生物設備工程有限公司;Avanti J－E高速冷凍離心機:美國貝克曼公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 種子制備

500 mL搖瓶裝種子培養基100 mL，接斜面活化好的菌種兩環，在28℃、搖床轉速180 r/min條件下培養24 h，備用。

1．2．2 分批發酵

在5 L全自動發酵罐中裝發酵培養基3 L，并加入0．05%的泡敵，在0．1 MPa、121℃的的條件下滅菌20 min，冷卻后接種 5%(體積比)，發酵溫度28 ℃，pH 6．0，直到發酵結束。

用復膜氧電極和pH電極在線測定發酵過程中的溶氧和pH變化，發酵過程中流加6 mol/L NaOH以控制pH，通過調節通氣量約1．0 L/min，攪拌轉速200～500 r/min，控制溶氧水平在20%以上，并在有必要時及時流加泡敵。每6 h取一次樣，測定總糖、菌體生物量和脂肪酶酶活，每次做3個平行試驗，取其平均值(相對誤差小于5%)。

1．2．3 分析方法

總糖的測定采用3，5－二硝基水楊酸(DNS)法［12］。

脂肪酶的活力測定采用堿滴定法［13］。

菌體生物量的測定采用干重法，取5 mL發酵液離心后，用蒸餾水洗2次，再離心，60℃烘箱內烘干至恒重后稱重。

1．2．4 數據處理

模型參數的優化及動力學參數的獲取均運用Origin 7．5對動力學方程非線性擬合獲得。

2 結果與分析

2．1 脂肪酶發酵過程代謝變化特征

在分批發酵過程中，白地霉PP1315脂肪酶發酵過程代謝變化如圖1所示。在0～18 h，菌體生長延遲期

，

該段時間內菌體碳源消耗少，菌體生物量增加較慢，脂肪酶產量為0，18 h后菌體進入對數期，菌體耗糖量明顯上升，脂肪酶產量隨著菌體的生長迅速增加，60 h進入穩定期后，菌體生物量幾乎不增加，耗糖量減少，但是脂肪酶產量繼續上升，96 h是活力達到最高240．15 U/mL，因此該脂肪酶的合成屬于生長部分耦聯型。96 h后脂肪酶合成速率也開始下降，108 h停止發酵。

圖1 白地霉PP1315脂肪酶發酵過程曲線

2．2 菌體生長動力學模型

對于細胞生長的動力學模型，由于在分批發酵過程中底物及菌體濃度對生長的限制作用不容忽略，故不宜采用Monod方程來描敘分批發酵菌體模型，目前多采用非結構模型來描述，Logistic方程能很好地反映分批發酵過程中菌體生長的一般規律，是目前應用較為普遍的方程之一，常用于細胞生長動力學的描述。同時，由于白地霉PP1315細胞生長曲線為S形，因此，將其應用于白地霉PP1315液體發酵中，可得白地霉PP1315生長的Logistic方程，其可積分為代數方程:

Logistic方程可積分為代數方程:

式(2)中:μm為菌體最大生長速率;X為菌體生物量/g/L;X0為初始菌體生物/g/L;Xm為最大菌體生物量/g/L;t為時間/h。

運用Origin 7．5對菌體生長試驗值按照公式(2)進行非線性擬合，結果如圖2。

圖2 菌體生長的試驗值與模型計算值的比較

菌體干質量(X)隨發酵時間變化的函數為:

式中:X0=0．008 96 g/L，Xm=23．587 g/L，μm=0．210 83。從圖2可知，式(3)的計算值可以較好的與試驗數據相吻合R2=0．988，該方程能夠作為白地霉PP1315脂肪酶合成優化控制的參考依據，發酵結束前期菌體自溶，導致試驗值與擬合值在發酵后期有較大的偏差。

2．3 脂肪酶合成動力學

在微生物的分批發酵過程中，細胞內的生物合成途徑十分復雜，其代謝調節機制特點各異。Gaden［14］根據產物生成速率與細胞生長速率之間的關系，將產物的形成與微生物細胞生長關系的動力學模式分為三類:Ⅰ產物形成與細胞生長偶聯型;Ⅱ產物形成與細胞生長部分偶聯型;Ⅲ產物形成與細胞生長非偶聯型。Luedeking和 Piret［14］對此進行了總結，提出了著名的Luedeking－Piret方程用來描述產物形成與細胞生長的關系。

Luedeking－Piret方程:

式中:α≠0、β=0表示第Ⅰ類發酵;α≠0、β≠0表示第Ⅱ類發酵;α=0、β≠0表示第Ⅲ類發酵。從白地霉PP1315分批發酵試驗結果可以判斷，白地霉PP1315產脂肪酶的發酵過程屬于產物形成與細胞生長呈部分偶聯型，結合式(2)和式(4)，Luedeking－Piret方程可積分為代數方程:

式中:P為脂肪酶酶活/U/mL;P0為初始脂肪酶酶活/U/mL;α為生長耦聯系數;β為非生長耦聯系數。

由于0 h時，P0=0，X0對產物的影響可以忽略不計，方程5可以簡化為:

運用Origin 7．5對白地霉PP1315脂肪酶合成發酵試驗值按照式(6)進行非線性擬合，結果如圖3所示，得到脂肪酶合成量(P)隨發酵時間變化的函數:

其中 α =4．346 36，β =0．104 36，在圖 3 可知式(7)能夠較好的擬合所得試驗數據(R2=0．925)，較好的描敘了發酵過程中脂肪酶的合成情況，脂肪酶在合成后期，發酵液中蛋白酶以及其他限制性因素的積累，脂肪酶緩慢變性導致失活，故在發酵后期試驗值與擬合值有所偏差。

圖3 脂肪酶活的試驗值與模型計算值的比較

2．4 基質消耗動力學

在白地霉PP1315脂肪酶發酵過程中，碳源的消耗主要有3個方面:一是用于細胞生長，二是細胞維持基本生命活動消耗，三是用于合成產物。基質消耗可以用與Luedeking－Piret相似的方程表示。

在分批發酵過程中，碳源的消耗可用如下動力學模型表示:

結合方程式(4)、(5)和(8)積分可得:

式中:S為總糖濃度/g/L;YX/S為碳源用于菌體生長的得率常數，λ=1/YX/S;γ為碳源用于產物積累的得率常數/h－1;

按照式(9)對發酵過程中總糖值進行非線性擬合，結果如圖4所示，得到基質消耗量隨發酵時間變化的方程:

式中:S0=19．584 g/L，λ =0．664 07，γ =－0．000 54。式(10)能夠較好的描敘脂肪酶合成過程中底物消耗的情況(R2=0．975)，由圖4可以看出發酵后期由于少量菌體自溶導致發酵后期試驗值與擬合值有一定偏差。

圖4 基質消耗的試驗值與模型計算值的比較

2．5 模型的驗證

為了檢驗模型的誤差，在相同試驗條件下進行3次發酵罐放大培養，所得試驗數據取平均值，實測值與模型預測計算值進行比較，結果見表1。模型預測計算值與實測值誤差在發酵開始期及其發酵后期較大，在發酵過程中誤差較小，總體來說絕大部分誤差低于10%，模型計算值能夠較好的反映實際發酵過程中的試驗值，因此該發酵動力學模型能夠較好地描敘白地霉PP1315產脂肪酶發酵過程中菌體生長、基質消耗和產物合成的變化規律。

表1 試驗值與預測計算值的比較

3 結論

本研究分別利用 Logistic方程和 Luedekingpiret方程描述了白地霉PP1315產脂肪酶的分批發酵過程，建立了菌體生長、脂肪酶合成和基質消耗的動力學模型。分別為:

(1)菌體生長動力學模型(2)脂肪酶合成動力學模型

(3)基質消耗動力學模型

試驗結果顯示，試驗值能夠與模型預測值較好擬合，菌體生長動力學模型的相關系數為 R2=0．988，基質消耗動力學模型的相關系數為 R =0．975，由于在發酵后期脂肪酶的緩慢失活，脂肪酶實際活力與模型理論值存在一定差異，脂肪酶合成動力學模型的相關系數為R2=0．925，但是總體上而言該模型的建立可以解釋白地霉PP1315脂肪酶動力學規律，可為實際發酵過程中菌體生長、產物合成及基質消耗的預測與控制提供參考。

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Establishment of Batch Fermentation Kinetics of Lipase Producing Strain Geotrichum Candidum

Wang Hui1Yuan Qiang1，2Zhang Ming1Li Jilie1Li Zhonghai1
(College of Life Science and Tech－nology，Central South University of Forestry and Tech－nology1，Changsha 410004)
(Hunan Weiming Chuanglin Bio － energy Co，．Ltd2，Changsha 410004)

The kinetics of lipase batch fermentation process was studied by Geotrichum candidum(PP1315)in a 5L stirred bioreactor．Firstly cell growth，product formation and substrate consumption throughout the lipase fermentation were investigated．The result showed that cell growth of PP1315 was characterized as an S － type curve，which presented a partial correlation with lipase synthesis．So，the partial coupling model was concluded．Based on variations of these process curves，the kinetics models for cell growth，lipase synthesis and substrate consumption were established according to the Logistic equation and Luedeking－Piret equation．Through the nonlinear regression and mathematical derivation，the optimal parameters in the above models were obtained．Finally，the kinetics equations of cell growth，lipase synthesis and substrate consumption，which was characterized in the batch fermentation process of PP1315，were obtained．

lipase，batch fermentation，kinetics model，nonlinear regression

Q814

A

1003－0174(2011)10－0061－05

國家林業局948計劃(2010－4－22)，國家科技支撐計劃(2009BADB1B10)

2010－12－23

王揮，男，1974年出生，博士，食品生物技術

黎繼烈，女，1959年出生，教授，食品生物技術