N5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與寧夏回族原發(fā)性高血壓的關系*

劉海燕 陳淑萍 馬 萍 徐清斌

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是影響人類健康最常見的心血管疾病，是由遺傳和環(huán)境因素共同作用而引起的多基因遺傳病。近年來,高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血癥被認為是心血管疾病的危險因素，并且可能參與了高血壓的病理生理過程[1]。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy代謝的關鍵酶，MTHFR基因677堿基C/T突變，產(chǎn)生MTHFR酶的不耐熱性變化，導致酶活性下降，使血漿Hcy水平升高及DNA低甲基化[2],從而產(chǎn)生一系列的病理變化。因此，MTHFR基因突變與高血壓的關系成為研究的熱點之一。雖然國內外開展了一些MTHFR基因多態(tài)性與高血壓發(fā)生的關聯(lián)性分析，但結論尚不一致，而且對少數(shù)民族人群的研究還很少，特別是對我國西北地區(qū)相對聚居的寧夏回族高血壓人群易感性的相關性研究更少見報道。本研究旨在探討寧夏回族人群MTHFR基因C677T多態(tài)性與EH的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選自2009年12月—2010年10月在寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院門診體檢者及住院的、長期居住于寧夏的回族患者（相互間無血緣關系、三代血親無異族通婚）。高血壓組（EH組）146例，男74例，女72例，平均年齡（48.28±16.03）歲。入選標準：符合2005年WHO/lSH高血壓治療指南分類標準：收縮壓≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mm Hg者，既往確診的高血壓患者或在2周內服用過降壓藥者；排除肝、腎、甲狀腺、糖尿病等疾病和藥物等引起繼發(fā)性高血壓的患者。對照組（NT組）112例，男63例，女49例，平均年齡（45.1±16.16）歲。入選標準：收縮壓<140 mm Hg，舒張壓<90 mm Hg，無服用降壓藥史，無高血壓病家族史，排除肝、腎、甲狀腺疾病及糖尿病等。

1.2 方法

1.2.1 一般臨床資料的收集 收集性別、年齡，測量心率、身高、體質量，并計算體質量指數(shù)（BMI），BMI=體質量/身高2（kg/m2）。

1.2.2 生化指標檢測 清晨空腹12 h抽外周靜脈血10 mL，5 mL行生化檢查，采用Olypuse公司2700型全自動生化分析儀檢測空腹血糖（GLU）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血尿酸（UA）、尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）。另外5 mL靜脈血EDTA-Na抗凝，-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜诨蚪MDNA的提取。

1.2.3 外周血白細胞抽提DNA 使用血液基因組DNA小量抽提試劑盒提取基因組DNA，試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.4 PCR擴增及檢測 （1）PCR擴增：引物設計使用Primer3InPut網(wǎng)絡軟件，上游引物為5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGC GGGA-3′，下游引物為5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′。反應體系 20 μL，10×buffer（Mg2+）2 μL，4 種脫氧核苷酸（dNTP，2.5 mmol/L）1.6 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，DNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 14.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30～35次，72℃延伸10 min。（2）酶切及電泳：對PCR擴增產(chǎn)物理想的樣品進行酶切分析。10 μL酶切體系包括PCR產(chǎn)物3 μL，HinfI內切酶 0.2 μL，10×buffer 1 μL，ddH2O 5.7 μL，BSA 0.1 μL，37℃水浴過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（溴化乙啶染色），室溫下恒壓100 V電泳30 min后取出凝膠，在凝膠成像儀中觀察基因診斷結果。

1.2.5 聚合酶鏈反應-限制性片段長度（PCR-RFLP）多態(tài)性技術檢測 MTHFR基因677位原有的C為T代替，產(chǎn)生HinfⅠ限制性內切酶酶切位點。本組PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)酶消化，產(chǎn)生3種基因型:野生型（C/C型）僅見198 bp片段；純合突變型（T/T型），酶切后產(chǎn)生175 bp和23 bp 2個片段，凝膠顯示175 bp 1條帶（后者已泳動至膠外）；雜合突變型（C/T型），既有198 bp片段，又有175 bp和23 bp片段，凝膠上顯示198 bp和175 bp 2條電泳帶，見圖1。資料用±s表示，組間均數(shù)比較做t檢驗，方差不齊采用近似t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較以及組間人群基因分布Hardy-Weinberg平衡檢驗用χ2檢驗。二元逐步Logistic回歸分析基因型與高血壓病易感性的關聯(lián)關系。檢驗水準雙側α=0.05。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 EH組和NT組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（EH組χ2=4.456 3，NT組χ2=2.155 1，P>0.05），表明研究對象來自同一群體，具有較好的代表性。

2.2 EH組和NT組一般臨床資料比較 2組收縮壓、舒張壓、脈壓、平均動脈壓、BMI、BUN、Cr、GLU、TG和心率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中EH組除了GLU和心率較NT組低外，其余各指標均高于NT組，其他各項2組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表l。

2.3 2組MTHFR基因型及等位基因比較 2組CC、CT和TT這3種基因型總體分布頻率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），EH組TT基因型高于NT組。EH組T等位基因頻率高于NT組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.4 不同MTHFR基因型間血壓水平比較 CT+TT基因型組和CC基因型組在舒張壓上差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但CT+TT型組的收縮壓、脈壓和平均動脈壓高于CC基因型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表1 EH組與NT組一般資料比較

表2 回族高血壓組與非高血壓組基因型及等位基因分布比較 例（%）

表3 不同基因型間血壓水平的比較 （mm Hg，±s）

表3 不同基因型間血壓水平的比較 （mm Hg，±s）

基因型CC型CT+TT型t n 115 143收縮壓131.83±20.52 139.27±21.22 2.837*舒張壓82.95±12.67 85.93±13.22 1.835脈壓48.89±13.99 53.34±14.3 2.508*平均動脈壓99.24±14.28 103.71±14.87 2.440*

2.5 Logistic回歸分析 以是否患有高血壓（0：否，1：是）為應變量，將基因型（CC型：0，CT+TT型：1）、性別（男：0，女：1）、年齡、BMI、GLU、UA、BUN、Cr、TC、TG、HDL-C、LDL-C、高血壓家族史（無：0，有：1）引入模型。采用逐步Logistic回歸分析結果顯示：CT+TT基因型、女性，BMI、TG、BUN增高為EH的危險因素，GLU為保護因素，見表4。

3 討論

EH作為多基因病的特征之一就是具有種族差異。回族是我國具有代表性的少數(shù)民族之一，他們的生活條件、飲食構成、地理環(huán)境以及宗教信仰等都可產(chǎn)生一定的制約性，有時甚至可以起到?jīng)Q定性作用[3]。寧夏是我國回族聚居的主要地區(qū)之一，由于回族禁止與非信仰伊斯蘭教的民族間通婚，因此形成了遺傳上相對的“隔離群體”，是獨特的人類遺傳資源[4]。EH在我國西北地區(qū)發(fā)病率較高，對寧夏回族人群進行遺傳多態(tài)性研究，可為回族人群的群體遺傳學研究提供理論依據(jù)，也為研究我國不同人群EH發(fā)病的遺傳機制和預防、治療回族高血壓起指導作用。

表4 多因素Logistic回歸分析結果

Hcy是一種血管損傷性氨基酸。有研究認為高Hcy血癥是心血管病的危險因素，血漿Hcy水平升高可以損傷血管內皮細胞，使內皮素-1合成增加,一氧化氮及前列環(huán)素分泌減少，破壞血管舒、縮因子的平衡[5]。另外高Hcy還可刺激血管平滑肌細胞增殖，引起內皮下水腫及纖維組織積聚，與高血壓的發(fā)病密切相關[6]。因此Hcy水平的升高可能參與了EH的病理生理過程。而MTHFR是影響Hcy代謝的關鍵酶，MTHFR基因第677位點上C→T的突變被認為是引起高Hcy血癥的主要原因之一。因此,MTHFR基因成為高血壓研究的候選基因，其突變與血壓值的關系引起了研究者的重視。

以往關于MTHFR基因C677T位點多態(tài)性與EH的關系研究結果報道不一。Lwin等[7]在研究日本男性MTHFR基因C677T多態(tài)性與高血壓和高尿酸血癥時，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T多態(tài)性與高血壓無關。Tylicki等[8]認為基因型頻率在EH和健康人群中的分布沒有差異，即此基因多態(tài)性與EH無關。然而，Golledge等[9]對土耳其人研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T多態(tài)性是高血壓的獨立危險因素。邢繡榮等[10]研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T多態(tài)性可能是北京城區(qū)漢族人群發(fā)生高血壓的危險因素。本研究結果顯示EH組MTHFR基因C677T位點變異型純合子TT頻率及T等位基因頻率均高于NT組。CT+TT基因型組的收縮壓、脈壓和平均動脈壓均高于CC基因型組。CT+TT基因型為EH的危險因素。由此得出，MTHFR基因C677T多態(tài)性可能與寧夏回族EH發(fā)病有關，攜帶MTHFR基因677位點變異體的人群患EH的危險性增加，T等位基因可能是寧夏回族人群EH的易感基因。本研究結果顯示GLU為EH的保護因子，可能是由于EH組大多選自住院患者，而NT組均來自門診健康體檢者，采血時由于活動、情緒應激等狀態(tài)不同，使得NT組GLU平均水平略高于EH組，實際上兩組入選者都是排除糖尿病的，故仍不能否認糖尿病是EH的危險因素。以上研究結果的不同，可能是血壓水平受基因因素和環(huán)境因素的共同影響。不同種族、人群的遺傳背景差異很大，基因多態(tài)性位點的作用強度不同，以及飲食習慣、居住環(huán)境、疾病、樣本量大小、統(tǒng)計方法選擇等都可能影響研究的結果，導致不同研究之間存在差異。

總之，EH是一種多基因復雜疾病，對于MTHFR基因多態(tài)性、基因-環(huán)境、基因-基因之間的相互作用對EH的確切影響還有待于研究者在樣本量、樣本構成、研究方法、人種及地理差異等方面進行進一步的綜合分析。

[1]宗永華，李小鷹，陳光亮，等.同型半胱氨酸水平與N5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性的關系[J].臨床心血管病雜志，2011，27（3）：203-207.

[2]任明保，柴曉芮，孫念怙.葉酸代謝異常與Down綜合征的風險因素[J].國外醫(yī)學·遺傳學分冊，2002，25（6）：341-343.

[3]南一，袁玲，馬英鋒，等.回回體質假說"的外延(三)---寧夏回族糖尿病合并高血壓[J].中國民族民間醫(yī)藥，2009（17）：150-153.

[4]徐金瑞，楊易，張東濤，等.寧夏回族原發(fā)性高血壓人群HLA-DQB1基因多態(tài)性分析[J].吉林大學學報(醫(yī)學版)，2009，35（6）：1103-1105.

[5]張向陽.加娜提,愛華.高同型半胱氨酸血癥大鼠血漿一氧化氮和內皮素1水平的變化:血管內皮功能損傷驗證[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（41）：8242-8246.

[6]徐志紅，陸國平，吳春芳.同型半胱氨酸對大鼠血管平滑肌細胞增殖及膠原生成的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（2）：226-229.

[7]Lwin H,Yokoyama T,Yoshiike N,et al.Polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase gene(C677T mthfr)is not a confounding factor of the relationship between serum uric acid level and the prevalence of hypertension in japanese men[J].Circ J,2006,70(1):83-87.

[8]Tylicki L,F?dinger M,Puttinger H,et al.Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms in essential hypertension relation:with the development of hypertensive end-stage renal disease[J].Am J Hypertens,2005,18(11):1442-1448.

[9]Golledge J,Norman PE.Relationship between two sequence variations in the gene for peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and plasma homocysteine concentration.Health in men study[J].Hum Genet,2008,123(1):35-40.

[10]邢繡榮，華琦.亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與高血壓及心臟結構功能的相關性[J].解放軍醫(yī)學雜志，2007，32（7）：741-744.