南極磷蝦蛋白酶分離純化及部分性質研究*

杭虞杰，李學英，楊憲時，遲海，郭全友

1(中國水產科學研究院東海水產研究所，上海，200090)2(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海，200093)

南極磷蝦蛋白酶分離純化及部分性質研究*

杭虞杰1，2，李學英1，楊憲時1，遲海1，郭全友1

1(中國水產科學研究院東海水產研究所，上海，200090)2(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海，200093)

對在南極磷蝦自溶過程中起主要作用的蛋白酶的分離純化條件和主要生化性質進行了研究。經過30% ～70%硫酸銨分級沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，Sephacryl S-200 HR凝膠層析后得到電泳純的蛋白酶，該酶純化倍數為12.59，產率為43%，分子質量約為28 ku;最適pH和最適溫度為pH 8.0和50℃;該酶pH穩定范圍為pH 7.0～9.5，并在45℃以下較穩定;苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)、對甲苯磺酰基賴氨酸氯甲基酮(TLCK)對該酶活性有較強的抑制作用。

南極磷蝦，蛋白酶，分離純化，性質

南極磷蝦是南極海域資源量最大的單物種生物之一，其巨大的生物量和潛在的漁業資源日益受到人們的關注［1－3］，開發利用南極磷蝦資源具有重大意義。南極磷蝦體內蛋白酶活力很強［4－6］，死后自溶很快，甚至在－18℃以下也有較強的自溶能力［7］。Konagaya等［6］研究認為，蛋白酶可能對南極磷蝦品質變化起主要作用。Osnes等［8］研究發現，類胰蛋白酶對南極磷蝦自溶起到40%的作用。本研究對南極磷蝦蛋白酶進行分離純化，并對其部分性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 原料

南極磷蝦由我國“南極海洋生物資源開發利用項目組”于2010年1月在南極FAO 48.1區捕撈，船上凍結后－23℃凍藏，－18℃條件下于2010年4月運抵實驗室后，在－28℃貯藏備用。

1.2 試驗試劑與儀器

主要試劑:偶氮酪蛋白(Azocasein)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，對甲苯磺酰基賴氨酸氯甲基酮(TLCK)，對甲苯磺酰基苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)均購自美國sigma公司;DEAE Sepharose Fast Flow，Sephacryl S-200 HR樹脂購自美國Amersham Biosciences公司;大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI)，上海研生生化試劑有限公司，其余化學試劑皆為國產化學分析純。

主要儀器:5810R高速冷凍離心機，Eppendorf，德國;LGJO-5冷凍干燥機，北京四環科技儀器廠;BS-100A自動部分收集器、BT01－100蠕動泵，上海精科實業有限公司;Power wave XS酶標儀，Biotek，美國;DS-1高速組織搗碎機，上海精科實業有限公司;電熱恒溫水浴鍋DK-S24，上海精宏實驗設備有限公司;pHS-2C型酸度計，上海偉業儀器廠;FA1004A電子天平，上海精天電子儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗酶液的制備

將新鮮的南極磷蝦，按1∶2(g∶mL)比例加入事先預冷到0℃的0.05 mol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液中，于高速組織搗碎機搗碎，4℃靜置4 h后，12 000 r/min離心30 min，取上清液，即為粗酶。加入質量分數為30%的(NH4)2SO4，4℃下靜置4 h，12 000 r/min離心15 min，取上清液后加入質量分數為70%的(NH4)2SO4，4 ℃條件下靜置4 h，12 000 r/min離心15 min，收集沉淀，按 1∶2(g∶mL)加入 0.05 mol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液，透析24 h后將溶液置于－80℃備用。

1.3.2 陰離子交換柱DEAE-Sepharose Fast Flow分離純化

取透析后的樣品5 mL經DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(2.5 cm×17 cm)進行分離純化，以0.05 mol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液洗去未掛柱的雜蛋白組分，再分別用含0.5、0.6、1 mol/L NaCl的緩沖液作階段式洗脫，控制流速為1.5 mL/min，5 mL/管收集，于280nm下檢測，繪制洗脫曲線并檢測蛋白酶活性，計算總蛋白質、比活力、產率和純化倍數，收集活性峰，透析后用PEG20000濃縮，－80℃保存備用。

1.3.3 DEAE-Sephacryl S-200HR分離純化

取濃縮后的樣品2 mL經Sephacryl S-200 HR凝膠過濾柱(1.6 cm×60 cm)進行分離純化，用含有0.15 mol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫，流速為0.4 mL/min，4 mL/管收集，280nm下檢測，繪制洗脫曲線并檢測蛋白酶活性，計算總蛋白質、比活力、產率和純化倍數，收集活性峰，透析后凍干，－80℃保存備用。

1.3.4 酶活力測定

［9］方法，以1%酪蛋白溶液為底物，0.5 mL酶液中加入等體積0.05 mol/L pH 7.5 Tris-HCl，于37℃恒溫水浴5 min，加入1 mL 1%酪蛋白溶液反應20 min后，加入1 mL 15%TCA終止反應，12000 r/min離心15 min，上清液于280 nm下測定吸光度;以先加入1 mL 15%TCA后加入0.5 mL粗酶液為空白樣。該條件下，每分鐘水解產生1 μg酪氨酸所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.3.5 蛋白質濃度測定

參考文獻［10］方法，采用考馬斯亮藍法測定酶液中的可溶性蛋白質含量。

1.3.6 蛋白酶分子量測定

根據 LaemmLi［11］的方法，進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。其中分離膠濃度為12%，電泳后用考馬斯亮藍R-250進行染色。

1.3.7 南極磷蝦蛋白酶最適pH測定

以1%酪蛋白為底物，37℃時，將酶液分別置于不同pH條件下(pH 5.0～11.0)，測定酶活力以確定最適pH。酶活力測定方法同1.3.4。其中不同的緩沖液分別為Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 5.0～6.6)，Tris-HCl緩沖液(pH 7.0 ～ 9.0)，甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.2～11)。

1.3.8 南極磷蝦蛋白酶最適溫度測定

pH 7.5時，以1%酪蛋白為底物，將酶液置于不同溫度條件下(20、30、40、50、60、70℃)測定酶活力以確定最適溫度。酶活力測定方法同1.3.4。

1.3.9 南極磷蝦蛋白酶熱穩定性及pH穩定性

37℃時，以1%酪蛋白為底物，將酶液置于不同pH環境中處理30 min后，測定酶液殘余活力，以確定南極磷蝦蛋白酶pH穩定性;酶液分別于35、45和50℃熱環境中處理不同時間后，在最適條件下測定殘余酶活力，以確定南極磷蝦蛋白酶熱穩定性。

1.3.10 抑制劑對酶活力的影響

選取 PMSF、EDTA、SBTI、TPCK 和 TLCK，配制濃度均為10 mmol/L。酶液與抑制劑等體積混合后，于37℃下恒溫水浴30 min，pH 8.0下測定殘留酶活，酶活力測定方法同1.3.4。抑制率計算:

2 結果與討論

2.1 南極磷蝦蛋白酶的分離純化

南極磷蝦經過Tris-HCl抽提、硫酸銨分級沉淀，所得的粗酶液經過DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析洗脫后出現了3個蛋白峰(圖1)，經過酶活性檢測后，前2個蛋白峰有活力，第2個峰活性很強，合并活性峰，用PEG20000濃縮后上樣于Sephacryl S-200凝膠層析得到2個蛋白活性峰，只有第2個峰有較強的活性，合并活性峰，透析后凍干。

圖1 南極磷蝦蛋白酶DEAE-Sepharose F.F.洗脫結果

圖2 Sephacryl S-200 HR凝膠層析洗脫結果

南極磷蝦蛋白酶經過陰離子交換層析和凝膠過濾層析后純化的活性組分與粗酶液相比有較明顯的提高純化倍數為12.59，產率為43%(見表1)。這較已報道的蛋白酶的產率的效果更好，但是分離純化倍數較低［12－13］，估計是分離純化過程中沒有達到優化，造成蛋白酶損失或純化較少。

2.2 南極磷蝦蛋白酶分子質量

粗酶液經過分離純化，用SDS-PAGE電泳測定其分子質量，結果見圖3。如圖3所示，南極磷蝦蛋白酶顯示為單一條帶，分子質量大約為28 ku，Kimoto［14］等對南極磷蝦腹部肌肉部分的蛋白酶進行分離純化，結果顯示，其分子質量大約為30 ku，這與本試 驗的結果相近。

表1 南極磷蝦蛋白酶純化

圖3 南極磷蝦蛋白酶SDS-PAGE電泳

2.3 南極磷蝦蛋白酶部分生化性質分析

2.3.1 南極磷蝦蛋白酶最適pH及pH穩定性

南極磷蝦蛋白酶最適pH和pH穩定性曲線見圖4。由圖4可知，pH 5.0～8.0時，酶反應速率逐漸升高，pH 8.0處達到最高;pH＞8.0時，酶反應速率開始逐步下降。該酶在pH 7.0～9.5之間比較穩定，剩余酶活力在80%以上，說明南極磷蝦蛋白酶在堿性環境中比較穩定。南極磷蝦蛋白酶在pH 6.5～9.5之間活性較高，這與南美白對蝦蛋白酶［15］和大西洋白對蝦蛋白酶［16］相近。

圖4 南極磷蝦蛋白酶的最適pH曲線及pH穩定性曲線

2.3.2 南極磷蝦蛋白酶最適溫度

南極磷蝦蛋白酶最適溫度曲線見圖5。由圖5可知，該酶在40～55℃活性較高，并在50℃時活性最高，這與吳志強［17］對太平洋磷蝦和 Ahsan［18］等對鳀魚蛋白酶最適溫度研究結果相似。超過50℃后，酶反應速率逐步降低。由此結果可知，南極磷蝦蛋白酶反應最適溫度為50～55℃。

圖5 南極磷蝦蛋白酶最適溫度曲線

2.3.3 南極磷蝦蛋白酶熱穩定性測定

南極磷蝦蛋白酶的熱穩定性研究結果見圖6。由圖6可知，酶在4℃下保存60 min，殘留酶活保持在90%以上，這與南極磷蝦棲息的環境相適應。45℃熱處理60 min后，酶活仍然保持在60%以上，表現出較好的熱穩定性;50℃時，酶活隨時間的延長迅速降低，熱處理60 min后，酶活損失86%以上。

圖6 南極磷蝦蛋白酶熱穩定性曲線

2.3.4 抑制劑對南極磷蝦蛋白酶活力的影響

不同抑制劑對南極磷蝦蛋白酶活力的影響結果見表2。由表2可知，PMSF對該酶活性有很強的抑制作用，說明該酶活性中心具有絲氨酸殘基，是一種絲氨酸蛋白酶;TLCK和SBTI對該酶也有很強的抑制作用，而TPCK對該酶基本沒有影響，說明該酶具有胰蛋白酶特性但沒有胰凝乳蛋白酶的特性。同時金屬蛋白酶抑制劑EDTA對酶活力無影響，說明該酶催化底物時不需要金屬離子的參與，南極磷蝦蛋白酶可能不屬于金屬蛋白酶。

表2 不同抑制劑對南極磷蝦蛋白酶活力的影響

3 結論

(1)粗酶液經過硫酸銨分級沉淀，DEAE-Sepharose F.F.陰離子交換柱，Sephacryl S-200 HR凝膠層析后得到電泳純級南極磷蝦蛋白酶，該酶比活力為13.63U/mg，純化倍數為12.59，產率為43%;該酶的分子質量約為28 ku。

(2)南極磷蝦蛋白酶的最適pH和最適溫度分別為8.0℃和50℃;并且有較好的pH穩定性和熱穩定性。

(3)南極磷蝦蛋白酶是種絲氨酸蛋白酶并具有胰蛋白酶的特性。PMSF，TLCK，SBTI對南極磷蝦蛋白酶有較強的抑制作用，抑制率分別為86%、93%和95%;TPCK，EDTA對該酶基本沒有影響。

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Partial Purification and Characterization of Protease from Antarctic krill(Euphausia Superba)

Hang Yu-jie1，2，Li Xue-ying1，Yang Xian-shi1，Chi Hai1，Guo Quan-you1
1(East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China)2(School of Medical Instrument and Food Engineering，university of shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China)

A protease that plays a role on autolysis of Antarctic krill was purified from Antarctic krill and its major physical and chemical characteristics were studied.The purified protease was obtained after 30% ～70%ammonium sulfate grading precipitation，DEAE-Sepharose Fast Flow anion-exchange chromatography and Sephacryl S－200 HR chromatography.The protease was confirmed by a single band on SDS-PAGE and was purified by 12.59-fold with the yield of 43%.The relative molecular mass of the enzyme was determined to be about 28 ku.The casein was used as substrate to measure the characteristics of the protease.The optimum pH and temperature of the enzyme were 8.0 and 50 ℃，respectively.The enzyme was stable when pH value is in the range of 7.0 to 9.5 and the temperature is blow 45 ℃;PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride)，SBTI(strontium bismuth titanate)and TLCK(N-α-Tosyl-L-Lysine Chloromethyl Ketone)can obviously inhibit the enzyme.

Antarctic krill，protease，purification，characterization