酶法制備乳源ACE抑制肽

于曉慶，王雄，司佳

（1.內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 011500；2.湖北工業大學 化學與環境工程學院，湖北 武漢 430068）

血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）在人體血壓調節過程中起重要作用。它催化血管緊張素I從C一端裂解二肽形成血管緊張素II，同時鈍化舒緩激肽，造成血壓升高。ACE抑制肽對ACE的親合度比血管緊張素I或舒張激肽要強，而且也不易從ACE結合區釋放。從而阻礙ACE催化血管緊張素I水解為血管緊張素II，催化舒緩激肽水解為失活片段，起降血壓作用。

牛乳蛋白是人類膳食蛋白質的重要來源，含有包括ACEI在內的多種生物活性序列。乳源ACE抑制肽是當前研究熱點，但加工過程中如何選擇合適的酶及控制酶解條件以獲得大量高活性ACE抑制肽是應用關鍵。乳源ACE抑制肽以安全性高、無副作用等優點在高血壓的防治中具有重要的研究和應用價值，已成為國內外科學家研究的熱點。本文利用酶技術從牛乳蛋白中提取ACE抑制肽[1]。

1 材料與分析方法

1.1 材料與試劑

牛乳蛋白：青海雪峰耗牛乳業酪蛋白干酪素生產公司；胰蛋白酶：廣州明遠工貿有限公司；蛋白酶A：合肥博美生物科技有限責任公司；木瓜蛋白酶：鄭州市綠邦科貿有限公司；胃蛋白酶：河南省可以化工有限公司；血管緊張素轉化酶（ACE）：長春匯力生物有限公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）：上海亨代勞商貿有限公司。

1.2 實驗儀器

XW-80A型旋渦混合器：上海醫科大學儀器廠；755S型分光光度計：上海棱光技術有限公司；pHS-4酸度計：上海偉業儀器廠；冷凍干燥機：杭州翔盛氣體設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ACE抑制活性的檢測方法

參照Nakamura方法，并作了修改，如反應時間、反應體系的大小、離心時間和速度、乙酸乙酯的萃取量等。

1.3.2 游離氨基酸的測定

取10 mL水解液加入30 mL去二氧化碳蒸餾水，混勻。用酸度計測其pH，用0.1 mol/LNaOH標準溶液滴定至pH8.2，加入甲醛溶液20 mL，1 min后，用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定至pH9.2，記錄消耗堿的體積V1（mL）；做空白實驗并記錄消耗堿的體積V2（mL），則水解物的游離氨基酸濃度（mmol/mL）：

游離氨基酸濃度=M（V1-V2）×1000/10，式中：M為NaOH標準溶液濃度，（mol/L）。

1.3.3 蛋白質水解度（DH）的測定

采用pH-stat法。

1.3.4 乳蛋白源ACE抑制肽的精確制備

稱取一定量的牛乳蛋白，于pH7.4的磷酸鹽緩沖液溶解。置于恒溫水浴鍋中，當水浴溫度達到水解溫度時，加入HCl或NaOH調至預定的pH，然后加入一定量的酶水解。在水解過程中不停地攪拌，并不斷加入適當濃度的NaOH以維持pH在規定范圍（±0.05）內，記錄加堿量和時間。到預定時間后，將反應體系在沸水浴中保溫30 min，中止反應。將水解物4000 r/min離心30 min，取沉淀冷凍干燥，然后精確稱取一定質量的凍干粉進行ACE抑制活性檢測。

1.3.5 半抑制濃度（IC50）的測定

稱取一定質量的樣品，配制成不同濃度的溶液，測定其ACE抑制活性。以濃度為橫坐標，抑制活性為縱坐標繪制曲線，計算IC50值。

2 結果與討論

2.1 水解用酶的選擇

底物質量分數為3%、酶質量分數為3%，分別在各種蛋白酶的最適溫度、pH條件下水解牛乳蛋白10 h。反應結束后放在95℃的水浴鍋中保溫30 min使酶失活，然后離心得上清液。冷凍干燥后進行ACE抑制活性測定，測定結果如表1所示。

表1 酶與抑制活性的關系Table 1 Relationship between enzyme and inhibitory activity

由表1可以看出，4種蛋白酶水解液的ACEI活性有明顯差異。蛋白酶A和木瓜蛋白酶水解全乳蛋白產生的ACEI活性較高。胃蛋白酶和胰蛋白酶水解液ACEI活性較低。而空白對照無ACEI活性。對表1中的ACE酶抑制劑進行方差分析可知，胰蛋白酶與蛋白酶A，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶之間差異顯著。胃蛋白酶與木瓜蛋白酶，蛋白酶A，胰蛋白酶之間差異顯著。而蛋白酶A與木瓜蛋白酶差異不顯著。木瓜蛋白酶屬植物蛋白酶，其酶活力比其它蛋白酶低，水解速度慢。木瓜蛋白酶是以番木瓜未成熟果實的新鮮乳汁為原料，經分離提取制得，價格相對較高，不適于工業化生產。綜合考慮，本實驗選擇蛋白酶A作實驗用酶[2]。

2.2 蛋白酶A酶解條件優化

以蛋白酶A作為實驗酶，采用四因素三水平的正交試驗設計確定最佳的水解條件。由正交試驗得出，各因素對ACE抑制活性指標影響的主次順序：溫度>酶用量>pH>底物濃度。最佳反應條件為：溫度52℃，酶用量3%，底物質量分數4.5%，pH7。

2.3 水解時間的優化

在一定條件下水解。分別抽取樣本，然后進行冷凍干燥，分析ACE抑制活性，見圖1。

由圖1可知：水解過程中，ACE抑制活性隨著水解時間的延長不斷升高，當水解時間到9.5 h左右時，ACE抑制活性達到最大值。當繼續水解時，ACE抑制活性降低，這是由于水解時間延長，讓已生成的ACE抑制肽部分被水解，生成活性較小或沒有活性的多肽。

2.4 水解過程中水解度、游離氨基酸含量的變化

水解過程中水解度、游離氨基酸含量的變化見圖2、圖3。

圖1 抑制活性與水解時間的關系Fig.1 Relationship between inhibitory activity and hydrolysis time

圖2 水解度與水解時間的關系Fig.2 Relationship betweeen degree of hydrolysis and hydrolysis time

圖3 游離氨基酸濃度與水解時間關系Fig.3 Relationship between dissociation amino acid density and hydrolysis time

由圖2可知，隨著水解時間的增加水解度不斷地增大，當水解時間到9.5 h以后，水解度基本不再改變。由圖3可知，游離氨基酸濃度隨著時間的增長先不斷地增大，然后保持穩定，當到達9.5 h以后又開始繼續增長。所以水解時間過長，不利于提高ACE抑制活性。

2.5 半抑制濃度的測定

在比較各種食品來源的ACE抑制肽活性強弱時，IC50是最直觀的評價指標。以ACE抑制活性為縱坐標、酶解物的濃度為橫坐標，繪制酶解物濃度與ACE抑制活性關系曲線，見圖4。

圖4 抑制活性與酶解物濃度的關系Fig.4 Relationship between inhibitory activity and hydrolysis density

由圖4可知，隨著酶解液濃度增大，抑制活性增大。但濃度達到某一特定值時，抑制活性保持穩定。根據圖4曲線的性質進行二次回歸分析，其回歸方程為y=-6.9542x2+43.49x+12.691（R＝0.9995），由此推算出酶解液的IC50=1.0263 mg/mL。

3 結論

1）從4種蛋白酶中篩選出能夠產生具有較高ACE抑制活性的蛋白酶A，通過正交試驗得出最佳反應條件為：pH7、溫度52℃、底物質量分數4.5%、酶用量3%。通過單因素試驗確定了最適酶解時間為9.5 h。

2）在蛋白酶解反應過程中，隨著反應時間的過度延長，水解度略有增加，游離氨基酸含量大幅度增加，此時不利于增加其ACE抑制活性，反而會生成較多的游離氨基酸，不利于ACE抑制肽的生產。

3）乳源蛋白源ACE抑制肽的半抑制濃度為1.0263 mg/mL。

[1]姜瞻梅，霍貴成，呂桂善.不同食物來源的ACE抑制肽的研究現狀[J].食品研究與開發，2003，24(1)：27-29

[2]姜瞻梅，田波，吳剛，等.酶解牛乳酪蛋白制備ACE抑制肽的研究[J].中國食品學報，2007，7(6)：39-43

[3]李朝慧，羅永康，王全宇.乳清蛋白酶解制備ACE抑制肽的研究[J].中國乳品工業，2005，33(2)：8-11

[4]管驍，姚惠源.酶法制備燕麥麩蛋白ACE抑制肽的研究[J].食品與機械，2006，22(6)：12-14