彌漫性腦損傷大鼠皮質和海馬中BrdU和Nestin蛋白的表達

韓寧娟，張孝剛，楊 靜，張文娟，劉光旭，郭淑香，楊 波，張廣政#

1)鄭州大學基礎醫學院法醫學教研室鄭州 450001 2)鄭州市公安局刑偵支隊鄭州450004 3)鄭州大學第一附屬醫院神經外科鄭州 450052

#通訊作者，男，1963年7月生，博士，副教授，研究方向:法醫臨床與司法精神病學，E-mail:zgz@zzu.edu.cn

彌漫性腦損傷大鼠皮質和海馬中BrdU和Nestin蛋白的表達

韓寧娟1)，張孝剛2)，楊 靜1)，張文娟1)，劉光旭1)，郭淑香1)，楊 波3)，張廣政1)#

1)鄭州大學基礎醫學院法醫學教研室鄭州 450001 2)鄭州市公安局刑偵支隊鄭州450004 3)鄭州大學第一附屬醫院神經外科鄭州 450052

#通訊作者，男，1963年7月生，博士，副教授，研究方向:法醫臨床與司法精神病學，E-mail:zgz@zzu.edu.cn

彌漫性腦損傷;5-溴-2-脫氧尿苷;巢蛋白;損傷時間;大鼠

目的:觀察大鼠彌漫性腦損傷(DBI)后不同時間皮質和海馬中5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)和巢蛋白(Nestin)蛋白的變化，探討其與腦損傷時間的關系。方法:成年健康SD大鼠36只，隨機分為對照組(6只)和實驗組(30只)。實驗組大鼠制作DBI模型后用免疫組織化學方法觀察腦損傷后不同時間(1、3、7、14和28 d，n=6)皮質和海馬中BrdU和Nestin蛋白的表達。結果:與對照組相比，實驗組大鼠DBI后不同時間腦皮質、海馬中的BrdU及Nestin陽性細胞均增加(BrdU:F皮質=141.447，F海馬=48.361，P均＜0.001;Nestin:F皮質=94.159，F海馬=98.183，P均＜0.001)。傷后1 d，皮質和海馬內就有BrdU和Nestin陽性細胞的大量表達;皮質內BrdU陽性細胞的表達于3 d達到高峰，Nestin陽性細胞的表達于7 d達到高峰，均持續至第14天后開始下降;海馬內BrdU和Nestin陽性細胞的表達于第7天達到高峰，其后逐漸下降。結論:BrdU和Nestin蛋白表達所呈現出的時序性變化規律，可望用于DBI損傷時間的推斷。

閉合性彌漫性腦損傷(diffuse brain injury，DBI)是法醫實踐經常遇到的一種顱腦損傷，這種類型的腦損傷無集中的腦挫傷表現，病理形態改變無明顯的時序性變化，需要尋找與其損傷相關的生物學指標來幫助推斷損傷時間。目前，國內法醫病理學者［1］對特異性蛋白在腦損傷后的變化規律有部分研究，但對DBI的研究較少。作者觀察了大鼠DBI后不同時間內皮質和海馬中5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)和巢蛋白(neuroepthelial stem cell protein，Nestin)表達的變化，探討其與腦損傷時間的關系，為DBI時間的鑒定提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 成年健康SD大鼠36只，雌雄不限，體質量(250±20)g，由河南省實驗動物中心提供。隨機分為對照組(6只)和實驗組(30只)。實驗組根據傷后不同時間取材，分為損傷后1、3、7、14和28 d組，每組6只。所有動物室溫飼養，自由進食水。

1.2 動物模型的建立 實驗組大鼠按改良的Marmarou法［2］制作DBI模型:用10 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射(30 mg/kg)麻醉后，將其俯臥固定于已知厚度及彈性系數的海綿床上，用一特制鐵頭盔套于頭頂，頭盔中央對準打擊管下口。待動物開始蘇醒，略有肢體活動時，用450 g鐵棒從1.5 m高度自管內自由墜落至特制頭盔正上方，立即移開海綿床以免二次損傷。觀察打擊中及打擊前后動物呼吸、肢體活動及神經體征的變化。對照組不予任何特殊處理，直接斷頭處死。

1.3 大鼠腦組織皮質和海馬內BrdU及Nestin的免疫組織化學檢測 所有實驗動物處死前1 d腹腔注射BrdU，共3次，每4 h 1次，每次50 mg/kg。各組大鼠于相應時間點處死后經心臟灌注肝素化生理鹽水10 min，然后用40 g/L多聚甲醛快速滴注20 min。心臟灌流后斷頭取腦組織，在大腦正中處作冠狀切面，取材厚度約5 mm，40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片厚度4 μm，分別進行常規HE染色、BrdU和Nestin免疫組織化學染色。用PBS代替一抗作陰性對照，使用已知陽性切片作陽性對照。鼠抗Brdu單克隆抗體、兔抗鼠Nestin多克隆抗體和即用型SP免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。用Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統，高倍視野下，每張切片選取4個不同視野(共計數200個細胞)，分別對BrdU和Nestin陽性細胞(胞核內著棕黃色顆粒且密度不均者為Brdu陽性細胞;細胞呈三角形或梭形、胞質呈棕黃色為Nestin陽性細胞)進行陽性細胞計數。

1.4 統計學處理 采用SPSS 10.0進行統計分析，先對每組數據作正態性檢驗，再作方差齊性檢驗。應用單因素方差分析及LSD-t檢驗比較大鼠DBI后不同時間海馬和皮質BrdU、Nestin陽性細胞數的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況 實驗組大鼠受打擊后，多數出現即刻昏迷癥狀(聽覺反射、痛覺反射和角膜反射均消失)，呼吸暫停數秒至數十秒，自主呼吸出現后由快到慢;大多動物出現豎毛現象和數十秒甚至更長時間的全身痙攣;完全蘇醒后以上癥狀會逐漸好轉，但普遍出現反應遲鈍、活動和進食減少的現象。

2.2 大鼠腦組織病理學變化 見圖1。實驗組損傷呈全腦彌漫性分布，損傷早期(第1天)腦實質內可見出血點;神經元腫脹，體積增大，核膜不清，周圍出現空隙;毛細血管擴張充血，炎癥細胞附壁。損傷后3 d可見腦組織疏松，神經元周圍出現較多間隙，膠質細胞反應性增生，損傷血管周圍可見大量淋巴細胞和單核巨噬細胞聚集。對照組未見明顯改變。

2.3 大鼠DBI后不同時間BrdU、Nestin陽性細胞數的變化 對照組大鼠大腦皮質和海馬存在少量BrdU陽性細胞，散在分布，呈弱陽性;Nestin在海馬區低水平表達，在皮質內無表達。實驗組大鼠腦皮質和海馬BrdU、Nestin陽性細胞增多。見圖2、表1。

表1 大鼠DBI不同時間BrdU和Nestin陽性細胞數的變化 個

3 討論

BrdU是胸腺嘧啶核苷的類似物，當細胞處于DNA合成期時，摻入到新合成的DNA中，可作為增殖細胞的標記物。理論上，損傷后BrdU標記的增殖細胞可能與進入凋亡細胞的BrdU及參與DNA修復的BrdU相混淆，但Moore等［3］研究發現BrdU僅在神經發生時可檢出，在DNA修復峰期不能被檢出，所以可以用BrdU來觀察新生細胞的增殖變化。作者研究發現，腦損傷后1 d后，皮質內BrdU陽性細胞顯著增加，3 d后達到高峰，一直持續到14 d后逐漸下降，至28 d后仍高于正常水平;腦損傷1 d后，海馬內BrdU陽性細胞數較對照組顯著增加，至7 d后達到高峰，14 d后開始明顯下降，至28 d仍高于正常水平。從這一系列變化中也可以看出腦損傷后BrdU表達水平變化呈一定的時程規律性。

Nestin是一種胚胎時期表達的第Ⅵ類中間絲蛋白，為神經干細胞的標志物之一，主要存在于胚胎時期的中樞神經系統，胚胎晚期隨著干細胞的分化成熟，逐漸被膠質纖維酸性蛋白、神經絲蛋白等中間絲蛋白所代替。在機械性腦損傷、腦缺血及興奮性毒性腦損傷等應激刺激下，神經細胞可出現胚胎期的逆轉，特異性及一過性地表達Nestin蛋白［4］。屈建強等［5］研究發現在大鼠腦挫傷后Nestin的表達具有一定的時序性。作者的研究結果顯示大鼠DBI后1 d，皮質內Nestin陽性細胞開始顯著增加，3 d后達到高峰，持續至14 d，損傷后28 d明顯下降，但仍高于對照組;海馬區Nestin陽性表達的細胞數在損傷后1 d后明顯增加，7 d后達到高峰，一直持續至損傷后14 d。此結果與Chen等［6］的研究有所不同，與Urbach等［7］的研究結果基本一致。Chen等［6］研究發現腦損傷后神經前體細胞在傷后28 d恢復到對照組水平，Urbach等［7］發現腦損傷后神經前體細胞增殖可持續至損傷后6周。以上結果有所不同可能與所選動物種屬、月齡或損傷模型不同有關。

Nestin陽性細胞可以看作是神經干細胞，BrdU陽性細胞可以看作是增殖細胞，所以Nestin陽性細胞和BrdU陽性細胞的多少，也可以從一個方面反映DBI后大腦的自我修復能力的強弱。該研究結果顯示在正常成年大鼠腦組織中僅少數部位存在少量的Nestin和BrdU陽性細胞，DBI后腦組織內Nestin和BrdU陽性細胞明顯增加，并且隨時間變化有一定的時序性，提示其可能為判斷腦損傷時間提供一種新的指標。在DBI發生后不同的時間段內，由于它們具有靈敏性和時序性優點，從而便于對它們進行檢測觀察，所以其對DBI的診斷具有一定的參考價值。Nestin陽性細胞和BrdU陽性細胞的變化具有一定的趨勢性，如能進一步研究出Nestin和BrdU增殖趨勢的平臺期，就可能推斷出腦損傷多久后腦細胞不再增殖，從而或許能為腦損傷傷殘鑒定的時限提供一定的理論依據。

該研究結果還顯示DBI后海馬及皮質區BrdU和Nestin陽性細胞的變化雖大體趨勢一致，但具體變化不一致，二者結合使用，可為進一步準確推斷腦損傷形成時間及大腦損傷的程度提供可能。此外，由于作者現在的研究僅局限于動物模型，如需在人體中加以實際應用尚有待進一步研究。

［1］黃平，劉巖峰，托婭，等.大鼠彌漫性腦損傷后S100β表達與損傷時間關系［J］.法醫學雜志，2006，22(1):4

［2］ Marmarou A，Foda MA，van den Brink W，et al.A new model of diffuse brain injury of rats.PartⅠ:pathophysiology and biomechanics［J］.J Neurosurg，1994，80(2):291

［3］Moore N，Okocha F，Cui JK，et al.Homogeneous repair of nuclear genes after experimental stroke［J］.J Neurochem，2002，80(1):111

［4］Shi M，Wei LC，Cao R，et al.Enhancement of nestin protein-immunoreactivity induced by ionizing radiation in the forebrain ependymal regions of rats［J］.Neurosic Res，2002，44(4):475

［5］屈建強，賀西京，楊平林，等.成年大鼠液壓沖擊腦損傷誘導室下區Nestin和GFAP的表達［J］.西安交通大學學報:醫學版，2004，25(5):436

［6］Chen S，Pickard JD，Harris NG.Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury［J］.Exp Neurol，2003，182(1):87

［7］Urbach A，Redecker C，Witte OW.Induction of neurogenesis in the adult dentate gyrus by cortical spreading depression［J］.Stroke，2008，39(11):3064

Expression of BrdU and Nestin protein in cortex and hippocampus of rats with diffuse brain injury

HAN Ningjuan1)，ZHANG Xiaogang2)，YANG Jing1)，ZHANG Wenjuan1)，LIU Guangxu1)，GUO Shuxiang1)，YANG Bo3)，ZHANG Guangzheng1)1)Department of Forensic Medicine，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001 2)Department of Criminal Detection，Police Station of Zhengzhou City，Zhengzhou 4500043)Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

diffuse brain injury;BrdU;Nestin;injury time;rat

Aim:To observe the alteration of BrdU and Nestin positiveness cells in the diffuse brain injury(DBI)rat and its relation to the injury intervals.Methods:A total of 36 healthy adult SD rats were randomly divided into control and experimental groups.Based on Marmarou’s model of DBI and took the samples at 1 d，3 d，7 d，14 d，and 28 d after brain injury.The expressions of BrdU and Nestin were observed by immunohistochemical staining in combination with imaging analysis.Results:Compared with the control group，at 1 day post-trauma，a significant increase in BrdU and Nestin postive cells was observed in the cortex and hippocampus tissue(BrdU:FCortex=141.447，FHippocampus=48.361，P＜0.001;Nestin: FCortex=94.159，FHippocampus=98.18，P＜0.001).The expression level of BrdU peaked at 3 days after injury and Nestin peaked at 7 days after injury in cortex tissue，then they decreased gradully at 14 days after injury.The expression level of BrdU and Nestin peaked at 7 days in hippocampus tissue，then they decreased gradually.Conclusion:Time-order expression of BrdU and Nestin could be used to estimate the time of brain injury in forensic pathology.

DF795.1

(2010-03-12收稿 責任編輯趙秋民)