小鼠微小 RNA294逆轉錄病毒載體的構建及鑒定＊

許 杰,閆秋月,湛彥強,張蘇明

華中科技大學附屬同濟醫院神經內科武漢 430030

#通訊作者,男,1952年 1月生,博士,教授,研究方向:干細胞再生與腦血管疾病,E-mail:huaxinxiaoqu@126.com

小鼠微小 RNA294逆轉錄病毒載體的構建及鑒定＊

許 杰,閆秋月,湛彥強,張蘇明#

華中科技大學附屬同濟醫院神經內科武漢 430030

#通訊作者,男,1952年 1月生,博士,教授,研究方向:干細胞再生與腦血管疾病,E-mail:huaxinxiaoqu@126.com

微小RNA;細胞重編程;逆轉錄病毒載體;小鼠

目的:構建小鼠微小 RNA294(miR-294)逆轉錄病毒載體。方法:從小鼠基因組 DNA擴增 pri-miR-294,克隆連接至pMX-IRES-GFP逆轉錄病毒載體上,得 pMX-miR-294-I RES-GFP,測序鑒定后以轉染 PLAT-E細胞進行病毒包裝,測定病毒滴度。結果:pMX-miR-294-IRES-GFP經 PCR擴增及測序鑒定正確,并得到了滴度為 (1～5)× 106TU/mL的病毒液。結論:成功構建了 pMX-miR-294-I RES-GFP逆轉錄病毒載體。

微小RNA(microRNA,miRNA)和誘導多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是目前生物學領域的兩個前沿。研究[1]表明,miRNA在動植物體內參與調控干細胞特性,并參與細胞生長、分化和凋亡,在胚胎發育過程中發揮著極其重要的調控作用。miRNA-290(miR-290)簇在小鼠胚胎干細胞多能性的維持方面發揮著重要作用,其中一些亞型對胚胎干細胞的細胞周期調控起著無可替代的作用,包括miR-291-3p、miR-294和miR-295,故被稱為胚胎干細胞細胞周期調控特異性 miRNA[2]。iPSCs的誘導目前多側重于基因和轉錄因子的研究,至于miRNA在 iPSCs的誘導過程中是否發揮作用目前仍不清楚。作者構建了miR-294逆轉錄病毒載體,用于研究miR-294在 iPSCs誘導過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 動物與質粒:孕 12.5 d昆明小鼠由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供;pMXI RES-GFP逆轉錄病毒載體由第四軍醫大學醫學遺傳學與發育生物學教研室韓驊教授惠贈。細胞來源:PLAT-E細胞和N IH3T3細胞購于廣州賽業生物科技有限公司,E.coliDH5α感受態細胞購于天根生化科技有限公司。酶類和試劑:限制性核酸內切酶(NEB公司),小提質粒提取試劑盒 (Omega公司),Lipofectamine2000脂質體轉染試劑 (Invitrogen公司),DMEM高糖培養基、胎牛血清和 2.5 g/L胰蛋白酶 (Hyclone公司)。器材:細胞培養箱 (Thermo公司),恒溫搖床 (華利達實驗設備公司),PCR儀(Applied Biosystems公司),熒光顯微鏡 (Olympus公司)。

1.2 pri-m iR-294的 PCR擴增 從 EMBL數據庫中獲取 pri-miR-294的序列,應用軟件設計引物,送至 Invitrogen公司合成。上游 (mmu-miR-294-B amHⅠ-F):5’-CGGGATCCCCTAAGTGTTGCATCATTTG-3’;下 游 (mmu-miR-294-XhoⅠ-R): 5’-CCGCTCGAGGTTCCAGGAAACCTTCATC-3’。上下游引物中分別含有B amHⅠ和XhoⅠ酶切位點。以小鼠基因組DNA為模板擴增。PCR擴增條件為:94℃預變性 5 min;94℃變性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,30個循環;最后 72℃延伸 5 min。純化并回收PCR產物。

1.3 重組逆轉錄病毒載體 p M X-mmu-m iR-294-IRES-GFP的構建和鑒定 純化后的 PCR產物經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后再次純化得到 pri-miR-294片段。pMX-IRES-GFP空載體用B amHⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收線性化空載體。取 1μL線性化載體(100 mg/L)與 1μL純化的 PCR產物 (100 mg/ L)在 T4 DNA連接酶作用下于 16℃連接過夜,轉化E.coliDH5α感受態細胞,均勻涂布在含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB平板上,37℃培養過夜。挑取少許菌落溶于 10μL LB培養液中混勻,取 1μL為模板,以引物 pBMN-5(位于多克隆位點的上游,5’-GCTTGGATACACGCCGC-3’)為上游引物,以 mmumir-294-XhoⅠ-R為下游引物進行 PCR擴增。擴增條件為:94℃預變性 5 min;94℃變性 30 s,60℃復性 30 s,72℃延伸 30 s,循環 30次;72℃延伸 6 min。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定;將陽性克隆進行培養,提取質粒后送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.4 逆轉錄病毒顆粒的制備及病毒滴度的測定將 4×106個 PLAT-E細胞[3]接種于多聚賴氨酸處理的培養瓶中,用無抗培養基 (體積分數 90% DMEM高糖溶液,體積分數 10%胎牛血清)進行培養。待 PLAT-E細胞融合度達 60%～80%時進行轉染。一 EP管中加入 20μL脂質體和 500μL OPTI,混勻靜置 5 min;另一 EP管中加入 8μg pMX-miR-294-IRES-GFP質粒和 500μL OPTI,混勻靜置 5 min;然后將兩管混勻,靜置 20 min。將混合液轉移至 PLAT-E細胞的培養瓶(棄去原有培養基)中,再加無抗培養基 4 mL,于37℃、體積分數5%CO2培養箱內繼續培養 48 h,熒光顯微鏡下觀察轉染后綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況。收集上清液。以孔徑為0.45μm的濾器過濾,收取約 5 mL病毒液,然后 4 000g離心至需要的病毒濃縮體積。將病毒濃縮液移出,分裝后 -80℃保存。采用逐孔稀釋滴度測定法進行病毒生物學滴度測定。

1.5 病毒感染 NIH3T3細胞 用無抗培養基培養N I H3T3細胞,待細胞融合度達 30%左右時進行感染。實驗分為感染組和對照組,分別取1 mL病毒液和 PBS液,均加入 0.5μL 80 g/L的 polybrene(終濃度為 4 mg/L),感染組 N I H3T3細胞加入病毒液,對照組加入 PBS液,同等條件下感染 12 h后觀察。

2 結果

2.1 目的基因擴增結果 以小鼠基因組為模板PCR擴增 pri-miR-294,得到 501 bp的片段(圖 1)。

圖1 pri-m iR-294PCR擴增產物

2.2 pM X-mmu-m iR-294-IRES-GFP的鑒定 重組質粒陽性克隆 PCR產物大小為 564 bp(圖 2),測序報告顯示重組質粒中插入的 pri-miR-294序列與GenBank中的序列一致。

圖2 陽性克隆PCR結果

2.3 病毒滴度測定 PLAT-E細胞轉染后 GFP的表達效率 >90%,結果見圖 3。病毒滴度為 (1～5)×106TU/mL。

2.4 NIH3T3細胞病毒感染后 GFP的表達 見圖4。

3 討論

2006年,Takahashi等[4]通過過表達 4種胚胎干細胞多能性基因 oct3/4、sox2、c-myc和 klf4,成功地將鼠胚胎成纖維細胞和成年鼠尾尖成纖維細胞逆向分化為 iPSCs;2007年,Takahashi等[5]和 Yu等[6]用同樣的方法獲得了人 iPSCs;之后,相繼出現了質粒iPSCs[7]和蛋白質 iPSCs[8]等。但上述方法基本上都側重于基因和轉錄因子的研究,即都是通過外源表達胚胎干細胞多能性基因從而打開內源開關,使其逆向分化。2009年,Judson等[9]首次報道運用 miRNA來誘導 iPSCs,將 iPSCs的研究引入了一個新領域,但其研究仍然依賴于 oct4、sox2和 klf4 3個多能性基因的過表達,單只應用 miRNA能否誘導得到iPSCs至今仍是一個未知數。已發現與胚胎干細胞關系最密切的是miR-290簇,其占據了鼠胚胎干細胞全部 miRNA的 70%以上[10],包括 miR-290至miR-295。隨著鼠胚胎干細胞的分化,以上 miRNA的表達迅速下降,其中miR-291-3p、miR-294和miR-295對胚胎干細胞的細胞周期調控起著無可替代的作用。

作者選擇了miR-294作為胚胎干細胞細胞周期調控特異性miRNA,將其構建在帶有 GFP標記的逆轉錄病毒載體 pMX-I RES-GFP上。常規研究 miRNA的方法多是將其miRNA構建在一般的真核表達載體上,繼而通過轉染靶細胞研究其基因下調或上調功能。該研究中選擇的是逆轉錄病毒載體,與其他類型的外源基因轉導方式相比,其轉導效率高,并且可持續表達。這與下一步運用miRNA誘導 iPSCs的需要是相符的,因為既往的研究[11]表明,iPSCs至少需要 12 d外源基因的持續高表達,所以如果選擇一般的真核表達載體進行瞬時轉染難以滿足 iPSCs誘導的需要。作者沒有選擇 pre-miRNA,而是將 primiRNA的基因序列構建在載體上,這是因為逆轉錄病毒載體屬于整合型病毒載體,選擇 pri-miRNA更接近于生物體內正常的miRNA的轉錄、剪切、出核及再剪切的成熟過程。所選用的 pMX-I RES-GFP載體上攜帶了一個 GFP基因,這樣可以直觀監測感染效率以及進行流式篩選。

作者成功構建了 pMX-miR-294-IRES-GFP逆轉錄病毒載體,為下一步運用miRNA來誘導 iPSCs提供了可能,且為進一步研究細胞重編程機制提供了一個平臺。

[1]王世華,邊春景,趙春華.microRNA在胚胎干細胞中的表達及作用[J].遺傳,2008,30(12):1545

[2]Wang Y,Baskerville S,ShenoyA,et al.Embryonic stem cell-specific microRNAs regulate the G1-S transition and promote rapid proliferation[J].Nat Genet,2008,40(12): 1478

[3]Morita S,Kojima T,Kitamura T.Plat-E:an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses[J]. Gene Ther,2000,7(12):1063

[4]Takahashi K,Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663

[5]Takahashi K,Tanabe K,OhnukiM,et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861

[6]Yu J,VodyanikMA,Smuga-Otto K,et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells [J].Science,2007,318(5858):1917

[7]Okita K,NakagawaM,Hyenjong H,et al.Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors [J].Science,2008,322(5903):949

[8]Zhou H,Wu S,Joo JY,et al.Generation of induced pluri potent stem cells using recombinant proteins[J].Cell Stem Cell,2009,4(5):381

[9]Judson RL,Babiarz JE,VenereM,et al.Embryonic stem cell specific microRNAs promote induced pluripotency[J]. NatBiotechnol,2009,27(5):459

[10]Marson A,Levine SS,Cole MF,et al.Connecting microRNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells[J].Cell,2008,134(3):521

[11]Brambrink T,Foreman R,Welstead GG,et al.Sequential expression of pluripotencymarkers during direct reprogramming of mouse somatic cells[J].Cell Stem Cell,2008,2 (2):151

Construction and identification of embryonic stem cell-specific microRNA294 retroviral vector ofmice

XU Jie,YAN Q iuyue,ZHAN Yanqiang,ZHANG Sum ingDepartm ent of Neurology,Tongji Hospital,Huazhong University of Science and Technology,W uhan 430030

microRNA;cellular reprogramming;retroviral vector;mouse

Ai m:To construct microRNA-294(miR-294)retroviral vector.Methods:pri-miR-294 amplified by PCR was inserted into pMX-IRES-GFP vector,and then identified by nucleotide sequencing.PLAT-E cellswere transfectedwith retroviral vector pMX-miR-294-IRES-GFP.All virus stockswere produced by calcium phosphate-mediated transfection.The titer of viruswas tested according to the expression level of GFP.Results:DNA sequencing demonstrated that pMX-miR-294-I RES-GFP was successfully constructed.The titer of concentrated viruswas(1～5)×106TU/mL.Conclusion:pMX-miR-294-IRES-GFP retroviral vectorwas successfully constructed,which paved the way for the induction of induced pluripotent stem cells and the investigation of cellular reprogrammingmechanism.

Q819

＊國家自然科學基金資助項目 30370505;武漢市科技計劃基金資助項目 200860423216

(2009-12-25收稿 責任編輯徐春燕)