生物熒光成像用分子與納米探針

李世琴，安文汀，李榮霞，趙俊紅，焦勇

（山西大學分子科學研究所，太原 030006）

1 引言

生物成像是一個多學科交融、多技術集成、發展迅速、應用廣泛的新興領域。以核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)和計算機體層攝影(Computed Tomography,CT)為代表，生物醫學成像在臨床診斷上發揮著不可替代的重要作用［1］。

生物熒光成像是近年來發展較快、引人矚目的生物成像方向之一。熒光技術因其快捷、靈敏、重復性好、無放射性，多個光物理參量（如激發波長、發射波長、熒光強度、熒光壽命、發射各向異性）可用于檢測等優點，在生命科學研究中獲得了廣泛應用［2-3］。熒光探針是生物熒光成像的核心技術之一。目前為止，熒光探針可大體上分為：（1）化學類：有機染料，納米材料（含半導體量子點、上轉換稀土納米粒子、貴金屬粒子、納米鉆石等），以及金屬配合物（含稀土配合物）等；（2）生物類：藻膽蛋白，基因編碼熒光蛋白 （如Green Fluorescent Protein,GFP）， 分子燈標（Molecular Beacon，一類發卡結構的寡聚核苷酸熒光探針）等。本文僅對目前應用最為廣泛的有機染料和研究最為活躍的半導體量子點及上轉換稀土納米粒子等化學類熒光探針，從發光機制、設計發展策略、合成制備方法以及生物成像應用實例等方面，予以簡要評述。

2 生物成像用熒光探針的一般屬性

一般地，適用于生物成像的熒光探針須具備以下性質：

（1）光物理性質：便于激發和檢測，不會與生物基質同時被激發，生物背景干擾小；較高的摩爾消光系數和熒光量子產率；

（2）化學性質：在相關緩沖液、細胞培養液或體液中較好的溶解性；使用條件下的熱、光穩定性；標記的位點特異性；

（3）生物相容性：標記所帶來的立體或尺寸相關的干擾效應要盡量小；易于進入細胞；標記的生物毒性小。

3 有機染料

有機染料是目前應用最為廣泛的一類熒光探針。有機染料的光物理性質取決于其分子的電子躍遷類型：（1）離域于整個發色團的共振躍遷，相應的染料稱為共振染料；（2）分子內電荷轉移躍遷，相應的染料稱為電荷轉移染料。依據結構－性質關系，可以通過精心的設計策略實現對發光性質的精細調控。大多數常見熒光探針，諸如熒光素類、羅丹明類、大多數的氟 硼熒類 （Boron-dipyrromethene,BODIPY）和花菁素類，都屬于共振染料。其特征是：相對較窄的、通常互為鏡像的吸收和發射帶；溶劑極性不敏感的、較小的Stokes位移；高的摩爾消光系數；中等或高的熒光量子產率。然而，吸收和發射光譜的有限的分離，使得不同染料之間的相互干擾不易避免。相反地，電荷轉移染料，例如香豆素類，在極性溶劑中則具有分離較好的、較寬的吸收和發射帶，較大的依賴于溶劑極性的Stokes位移。然而，摩爾消光系數和熒光量子產率通常較共振染料為之低。

有機染料類熒光探針的設計發展策略多種多樣。其中一種常見的設計發展策略就是基于某一類母體結構而不斷修飾、功能化的衍生策略。以羅丹明類染料為例，就是以氧雜蒽為母體結構而發展起來的一類堿性染料。早在三十年前，具有強紅色熒光的磺化羅丹明B和磺化羅丹明101衍生物就與熒光素連接在一起，被用于雙信號或多信號的熒光分析檢測［4-5］。此后，Lefevre等［6］利用6-氨基己酸將磺化羅丹明B和磺化羅丹明101衍生物連接起來，提高了熒光特性，使之更適于熒光標記。Nagano等［7］開發了一種基于羅丹明發色團的NO熒光探針，550nm激發，檢測限7nm，已成功用于活細胞的NO熒光成像。近來，復旦大學李富友等［8］發展了一種羅丹明類熒光染料，利用Cu2+與氧、硫原子的配位作用而引起羅丹明結構發生變化，實現Cu2+的胞內外檢測。

另一種設計發展策略可稱為靶標導向策略。例如，活性氧物種（Reactive Oxygen Species,ROS）熒光探針是近年來有機熒光探針的研究熱點之一。ROS與生命體的健康、老化和疾病都有密切關系。線粒體是細胞內氧氣的主要消耗者，是ROS的主要源頭，在ROS的生物學研究中居于中心地位。線粒體靶向的ROS熒光探針為揭示ROS的生化奧秘可提供高時空分辨率的強有力工具。線粒體靶向的ROS熒光探針的設計策略是：從功能要求出發，結構上由兩部分組成：（i）靶向載體部分，定向輸運分子到線粒體；（ii）高選擇性、特異性的分子開關部分，與特定ROS作用后，點亮熒光。例如，Chang等［9］報道了一例這類探針MitoPY1。它以親脂性陽離子三苯基膦（Triphenylphosphonium,TPP）基團為靶向線粒體的分子載體。靶向機理是，由跨線粒體內膜的質子梯度所形成的負電勢，可以使陽離子基團通過靜電作用定位于線粒體。分子開關部分機理是由硼酸基團選擇性地與H2O2反應，打開羅丹明的閉環結構，從而形成大共軛體系而產生熒光。Guo等［10］報道了一種H2O2和氧還金屬離子 “串連雙開關模式”的熒光探針，即只有在一定濃度的H2O2存在的前提下 （開關1），同時存在氧還金屬離子（開關2），熒光探針才會被 “點亮”。這種熒光探針在細胞的氧化脅迫狀態（H2O2水平）的實時檢測，以及活體組織的抗Fenton反應方面有較大應用潛力。

利用有機染料標記蛋白質等生物大分子，進而利用多種熒光成像手段研究被標記物種的跨膜行為，胞內分布，與特定細胞器的共定位，信號轉導路徑，以及生理及病理效應等活細胞熒光成像分析，在分子生物學、生理學和病理學研究領域越來越成為一種直觀有效的研究模式。

簡言之，有機染料分子小、結構簡單、可以快速通過很多生物屏障，且商品化的分子較多，在體內外熒光成像、DNA自動測序、抗體免疫分析、抗癌藥物開發、疾病診斷等方面應用廣泛。但一般而言，其光化學穩定性較差，易于光漂白和降解；Stocks位移較小，易于受到干擾而降低檢測靈敏度；熒光壽命在細胞和組織內停留時間較短，較難以實現長時間的實時動態信號追蹤，使其在生物醫學領域的應用受到了一定限制。

4 半導體量子點

半導體量子點（Quantum Dots,QDs）是一類由Ⅱ-Ⅵ或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的、粒徑小于或接近激子波爾半徑的納米粒子。其光物理性質表現出顯著的量子限域效應（Quantum Size Effect,QSE），即熒光的吸收和發射性質依賴于粒徑大小，隨著粒徑減小而藍移。半導體量子點具有以下獨特的光譜性質：（1）“寬激發，窄發射”，即激發波長范圍寬而發射波長范圍窄，因而可用同一波長同時激發多種量子點而獲得多色熒光；（2）發射峰較窄，峰形對稱，重疊小；（3）量子限域效應顯著，可以通過調節粒徑和組成來實現發射波長的調控；（4）熒光強度較高、穩定性及抗光漂白能力較強，便于對標記物進行長期、實時跟蹤觀察；（5）經表面修飾后，生物兼容性好，易于進行特異性連接，進而進行生物活體標記和檢測；（6）雙光子截面較大，可在較低激發強度下進行活體的深層組織成像。基于上述特點，近年來量子點在生物分子檢測、細胞和活體多色標記成像、正常及病變組織的定位和成像等領域的應用得到了快速發展。

量子點有多種合成方法，包括溶膠凝膠法、氣相沉積法、電化學沉積法和微乳液法等。早期由氣相沉積法制得的量子點粒徑分布寬，量子產率低。近年來研究發現，溶膠法制備的量子點具有很好的發光性能，成為目前應用最廣泛的制備方法。溶膠法分為有機相法和水相法兩種。盡管有機相法制備的量子點具有結晶性好、尺寸均一、粒度可調等優點，但該方法條件苛刻，原料昂貴，毒性大，易燃易爆，且制得的量子點在空氣中不穩定性，特別是納米晶表面通常包覆著憎水性基團，限制了其在生物成像的應用。比較而言，水相法有很多優點，如操作簡單、毒性小、成本低，最突出的就是可以根據需要直接設計成生物探針，無需進一步修飾。近年來發展的高溫水熱法和微波輔助水熱法等進一步提高了量子點的相關性能。我們實驗室主要采用水熱法合成水溶性CdTe/CdS殼核量子點，并將其應用于活細胞熒光成像。

量子點進一步與抗體或靶向性的小分子配體相偶聯，可用于細胞或亞細胞結構的特異性標記。1998年，Alivisatos等［11］報道了量子點的生物標記，初步解決了量子點的水溶性及與生物分子偶聯問題。Zhao等［12］利用細胞核特異性染料Hoechst 33342的“分子向導”作用，將其與水溶性CdTe量子點以非共價形式偶聯起來，成功地將量子點定位于活細胞的核酸負電骨架上。龐代文等［13］開展了基于量子點的熒光免疫技術研究，同時對乳腺癌的HER2和ER細胞進行了雙色熒光成像。張春陽等［14］利用雙光子掃描熒光顯微鏡，觀察、驗證了量子點標記的天花粉蛋白以受體介導的內吞方式進入人絨癌細胞的機理，及其在細胞內的分布。此外，用量子點標記前列腺特異性膜抗原（PSMA）的抗體，經小鼠尾靜脈注射，實現了對表達PSMA的前列腺癌的靶向成像［15］；量子點偶聯曲妥單抗，被成功地用于KPL-4荷瘤裸鼠中Her2的成像研究，在活體中觀察到量子點從血管逐步移入細胞核的整個過程［16］。

盡管QDs的應用研究非常廣泛，但目前仍面臨諸多挑戰：粒徑均一化控制較難，表面缺陷較多，影響發光穩定性；生物標記時多個生物分子會同時連接在量子點上，難于控制生物分子的取向、可能發生團聚；生物毒性問題等。另外，熒光的非單指數型衰減行為，使之不適用于時間分辨的熒光檢測。

有機染料和量子點的發光機制是光子能量損失的下轉換過程，即發射波長較激發波長為之長 （紅移）。當用紫外或藍光激發時，其在生物成像上所面臨的突出問題就是生物組織自體熒光產生的背景干擾。稀土上轉換納米粒子（Upconversion Rare Earth Nanoparticles,UCRE-NPs）有望克服這一難題。其發光機制是稀土納米粒子吸收兩個或多個低能光子而輻射一個高能光子的上轉換過程，即發射波長比激發波長短的反Stokes發光。利用稀土上轉換納晶的這一獨特優勢，以近紅外或紅外光為激發源，熒光成像時可大大降低或消除自體熒光干擾、提高信噪比和檢測靈敏度。同時，近紅外光還具有對生物組織幾乎無損傷的、高達十數厘米的穿透力。因而，近年來近紅外光激發－可見光發射的稀土上轉換納米粒子激起了人們越來越濃厚的研究興趣。

稀土上轉換納米材料的制備方法主要有熱分解法、水熱溶劑熱法、共沉淀法和溶膠凝膠法等。稀土氟化物是目前多種稀土上轉換納米材料中發光效率較高、應用較多的一種。熱分解法的典型步驟是，將預先制備好的三氟乙酸稀土鹽添加到高沸點有機溶劑（油酸、油胺等）中，氮氣保護下升溫至250-340℃，使三氟乙酸稀土鹽熱分解生成稀土氟化物納米晶體。北京大學嚴純華等［17］利用熱分解方法制備了單分散的LaF3三角納米盤，隨后通過改變溫度、加熱時間等條件，制備了各種形貌可控的不同晶相的稀土熒光納晶。稀土上轉換納米粒子的粒徑一般較大，通常在十幾、幾十或上百納米。為了使標記物更小、更穩定，近來Chen等［18］由熱分解法制備了粒徑7－10nm的上轉化NaYF4:Yb3+/Tm3+/Ho3+納晶，近紅外激發和發射，被稱為“生命組織的透明觀察窗”。清華大學李亞棟等［19］利用水熱合成法合成了形貌各異、粒徑可調的單分散納米晶體。

在制備得到結晶度好、摻雜均勻、粒徑均一、單分散性的稀土納晶后，為了適用于生物成像，需要進一步通過表面改性（如二氧化硅/聚合物包覆、配體交換/氧化）和靶向性修飾，使納晶具有良好的水溶性以及一定的靶向選擇性。Wang等［20］報道了利用固液兩相溶劑熱法合成NaYbF4上轉換納米粒子，通過調節摻雜稀土離子種類或濃度，實現了在單一近紅外波長980nm激發，可發射橙、黃、綠、青、藍等多色熒光上的轉換納米粒子。通過包覆硅殼層改善水溶性，并聯接兔抗－CEA8抗體，實現了活HeLa細胞的免疫標記和熒光成像。

作為新一代熒光探針，稀土上轉換發光納米材料除了具備前述的內稟優勢外，還有吸收和發射帶窄，Stokes位移大，光、熱穩定性好等優點，可以預見其在生物成像方面必將發揮越來越大的作用。

5 結論與展望

基于有機染料的生物成像仍然是目前發展最為成熟的、實用化熒光成像技術。有機染料為人們提供了一種簡捷、安全、相對價廉、使用標準化的熒光探針。盡管其光譜特性不是最優的，光化學穩定性也不是最高的，但有機染料以其變化無窮的完全共價構筑的小分子特性，繼續拓展著自身的發展空間。

以量子點和上轉換稀土納米粒子為代表的熒光納米粒子，具有誘人的應用前景。量子點和上轉換稀土納米粒子的突出優點就是可以實現單波長激發下的多色編碼，同時檢測，從而極大地簡化了多色成像。盡管熒光納米粒子具有獨特、優異的光譜性質和穩定性，但要在生物成像上真正實用化，還要進一步發展表面修飾技術，提高水溶性、表面包覆的穩定性、生物相容性和靶向性，并降低生物毒性。隨著研究的深入，新興的納米熒光探針在生物成像上將會發揮更大的作用。

毋庸置疑，生物成像用熒光探針是一個生機勃勃、充滿挑戰的領域。面對生命系統的復雜性，不存在通用的熒光探針工具。只有盡可能地研究開發更多種類的熒光探針才有可能滿足多方面的需求。不難預測，各類熒光探針的未來格局是，性能互補，共同發展，為生物成像提供更大的可選擇空間。

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