類風濕性關節炎患者caspase-7β亞型基因的多態性分析*

江雨霏， 沈 波， 金 翔， 陳佳喜， 朱 敏

(溫州醫學院附屬浙江省臺州醫院檢驗科，浙江 臺州 317000)

類風濕性關節炎患者caspase-7β亞型基因的多態性分析*

江雨霏， 沈 波△， 金 翔， 陳佳喜， 朱 敏

(溫州醫學院附屬浙江省臺州醫院檢驗科，浙江 臺州 317000)

目的： 探討中國臺州地區caspase-7 β亞型基因rs2227309多態性與類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)易感性的關系。方法對204位類風濕性關節炎患者與203位健康體檢者進行研究，采用熒光定量單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析的方法對caspase-7 β亞型基因rs2227309多態性進行檢測。結果RA患病組中GG、AG、AA基因型頻率分別為33.3%、53.4%、13.2%，健康對照組中GG、AG、AA基因型頻率分別為33.0%、44.3%、22.7%。RA患者組與健康對照組相比，caspase-7 β亞型基因rs2223709基因型分布的差異顯著(Plt;0.05)。RA患病組GG+AG基因型頻率高于健康對照組，差異顯著(Plt;0.05，OR=1.921，95%CI為1.140～3.236)。RA患者組與健康對照組中G等位基因頻率分別為60.0%與55.2%。RA患者組與健康對照組相比，等位基因分布的差異不顯著(Pgt;0.05，OR=1.221，95%CI為0.924～1.613)。結論Caspase-7 β亞型基因rs2227309可能與中國臺州地區人群類風濕性關節炎易感性有關，這種關系可能是由于caspase-7非功能亞型轉錄水平相對升高致使滑膜細胞凋亡活性減弱所致。

Caspase-7 β亞型； 基因多態性； 關節炎，類風濕性

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關節滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反復發作，可導致關節內軟骨和骨的破壞，關節功能障礙，最終殘廢。RA的發病機制尚未完全明確[1]，但已發現其發病與環境、細胞、病毒、遺傳、性激素及神經精神狀態等因素有關，特別是與滑膜細胞凋亡減弱密切相關[2]。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteases, caspases)是一組在細胞凋亡過程中起關鍵作用的酶[3]，可能與RA易感性有關。但RA患者接受不同藥物治療，凋亡相關蛋白的檢測容易受到其影響而出現干擾性差異。于是本研究擬通過檢測調查人群中caspase-7 β亞型基因rs2227309 (G/A)單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)，探討中國臺州地區漢族人群caspase-7 β亞型基因多態性與RA易感性的相關性，從而為探索RA的發病機制提供參考依據。

材 料 和 方 法

1對象

實驗分RA患病組與健康對照組。(1) RA患病組：RA患者204例，選取2009年1月至2010年11月在浙江省臺州醫院就診的患者，其中男50例，女154例，年齡20～82歲，平均年齡(51.6±11.5)歲。診斷均符合美國風濕病協會1987年修訂的RA分類診斷標準。(2) 健康對照組：選取2010年11月至12月在浙江省臺州醫院體檢中心檢查的健康者203例，無關節畸形，排除各種全身性炎癥疾病。其中男49例，女154例，年齡22～86歲，平均年齡(51.8±10.1)歲。以上研究對象均在知情同意的情形下取得。全部研究對象均來自臺州地區漢族人群，且無親緣關系。

2主要試劑

人全血基因組DNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，TaqMan? 熒光定量SNP分析探針以及PCR mix均購自Applied Biosystems。儀器使用Applied Biosystems公司的StepOnePlusTMReal-Time PCR System。

3方法

3.1標本收集與保存 空腹抽取研究對象靜脈血2 mL并以EDTA抗凝，-80 ℃冰箱保存備用。

3.2白細胞基因組DNA抽提 取上述抗凝血500 μL，按照全血基因組DNA提取試劑盒操作步驟進行，-80 ℃冰箱保存備用。

3.3Caspase-7基因型鑒定應用 使用Applied Biosystems公司的TaqMan?熒光定量SNP分析探針(TaqMan? SNP Genotyping Assays)，探針的熒光染料分別為綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein, VIC)與羧基熒光素(carboxyfluorescein, FAM)，其檢測的具體序列如圖1，VIC標記的探針檢測A等位基因，FAM標記的探針檢測G等位基因。總反應體系為20 μL，選用96孔板，每板設置1個陰性對照，每個標本檢測2次，若2次結果存在差異，或者其中1次結果模糊不清，則進行復查。嚴格按照試劑說明書進行操作，預變性95 ℃ 10 min，隨后進行40個循環(92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。

Figure 1. Caspase-7 rs2227309 gene sequences.

圖1Caspase-7rs2227309基因序列

4統計學處理

數據處理應用SPSS 17.0軟件包完成。RA患病組與健康對照組之間性別比對檢驗采用2檢驗，年齡比對檢驗采用成組t檢驗。基因型頻率采用累積計算法求得，Hardy-Weinberg平衡檢驗采用2檢驗。由基因型頻率直接計算等位基因頻率，組間基因型及等位基因頻率比較采用2檢驗。

結 果

1RA患者組和健康對照組基本特征

如表1所示，RA患者組與健康對照組年齡和性別無顯著差異。RA患者組病程為(10.1±8.2) 年，血清類風濕因子(rheumatoid factor，RF)和抗環瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體陽性率分別為84.8%和92.6%；健康對照組未檢出上述RA相關血清因子。

表1 實驗對象的臨床資料及分組信息

2Hardy-Weinberg平衡檢驗

3RA患者組和健康對照組基因型頻率和等位基因頻率分布比較

表2顯示，RA患者組的GG與GA基因型總和高于健康對照組，Plt;0.05，差異顯著。

表3顯示，RA患者組等位基因G的比例略高于健康對照組，Pgt;0.05，差異不顯著。

表2 RA與健康對照組caspase-7 rs2227309基因型相對危險度分析

表3 RA與健康對照組caspase-7 rs2227309等位基因相對危險度分析

討 論

RA是一種病因學尚未完全明了的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其主要特征為持續性滑膜組織炎癥和漸進性關節破壞。即滑膜炎持久反復發作，可導致關節內軟骨和骨的破壞，關節功能障礙，最終殘廢。RA是最常見的風濕性疾病之一，分布于所有的種族和民族，可發生于任何年齡段，但隨著年齡的增加其發病率呈上升趨勢。患者男女比例通常為1∶3。

本病的病因尚未完全明確，一般認為，RA是具有遺傳傾向的易感人群在受到未知抗原刺激后所產生的自身免疫反應性疾病，發病與環境、細胞、病毒、遺傳、性激素及神經精神狀態等多種因素有關[4]。目前研究顯示，成骨細胞增生與滑膜巨噬細胞、成纖維細胞和淋巴細胞凋亡減弱的不平衡可能是導致RA持續發展的一個機制。RA患者成骨細胞的凋亡增加可能致關節周圍骨損害，而類風濕滑膜細胞的凋亡削弱似乎導致滑膜組織增生[2]。并且，動物研究表明，在關節炎模型中，誘導滑膜細胞凋亡的增加，改善了滑膜組織的增生[5-6]。

Caspases是一類進化上高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡過程中起關鍵作用。Caspase與多數蛋白酶一樣在胞內以無活性的酶原形式存在，酶原由N-端前結構域(prodomain)、大約20 kD的大亞基(p20)和大約10 kD的小亞基(p10)3部分組成。成熟caspases酶蛋白都須通過水解prodomain序列，分別由2個p20亞基和2個p10亞基進行組裝，從而激活[7]。活化的caspase可水解底物,并通過級聯放大誘發凋亡。目前已發現的caspases有14種, 分為炎癥caspases、啟動子caspases和效應子caspases 3類[8]。根據起始激活的caspase不同，凋亡激活途徑分為3種，而最終都導致效應子caspases(caspase-3、caspase-6和caspase-7)的反應，引起細胞凋亡[9]。

大鼠實驗表明，缺乏caspase-7會導致凋亡減弱[10]。基于caspase-7在凋亡中的作用，它可能是自身免疫性疾病易感性的影響因素之一。但是由于RA患者接受不同藥物的治療，并且許多治療可能影響到凋亡途徑，因此直接檢測caspase-7蛋白表達容易受其影響。而caspase-7基因定位于10q25.1-10q25.2，已經發現其相鄰區域10q21和10q26與RA的易感性有關[11]，于是近年來出現針對caspase-7基因多態性與RA易感性的研究。

本實驗中, 健康對照組人群中rs2227309位點上AA基因型者占全組人群的22.7%，AG基因型者占全組人群的44.3%，GG基因型者占全組人群的33.0%，基本符合此前研究公布的基因頻率。RA患病組中，AA基因型患者占全組人群的13.2%，AG基因型患者占全組人群的53.4%，GG基因型患者占全組人群的33.3%。RA患病組AG+GG基因型含量相對較高，差異具有統計學意義。進而分析其等位基因，健康對照組人群中A等位基因占44.8%，G等位基因占55.2%；RA患者組A等位基因占40.0%，G等位基因占60.0%。RA患者組G等位基因的頻率較健康對照組略高，但差異不顯著。我們可以假設RA患者組AG基因型與GG基因型的比例均高于健康對照組，所以基因型差異比較顯著，而RA患者G等位基因的增高并不明顯。

我們發現GG基因型與AG基因型合并組的危險度最高(OR=1.921，95%CI:1.140～3.236，Plt;0.05)。而AG基因型頻率OR=1.441，GG基因型頻率OR=1.015，即AG基因型與RA易感性的關系更加顯著。這也可以解釋RA患者單獨G等位基因的增高并不顯著。我們推測，caspase-7 rs2227309基因位點GG+AG基因型頻率與RA的易感性有關。

如今已經發現，通過對caspase-7基因轉錄產物進行不同剪切拼接可以產生4種mRNA，編碼3種不同的caspase-7亞型。其中最大的亞型為δ亞型，由mRNA的δ型(又稱為α’型)編碼。Caspase-7 α亞型是一個有303個氨基酸殘基的多肽鏈，屬于功能亞型，參與促進細胞凋亡的過程，由mRNA的α型或γ型編碼。此外，caspase-7 β亞型是其最小的亞型，由253個氨基酸殘基組成，它與α亞型的C端序列不同，缺乏酶的活性位點，可能作為主要的caspase-7活性形式抑制劑，由mRNA的β型編碼[12-13]。Caspase-7 rs2227309編碼定位于蛋白的C-末端，對非β亞型無影響，在β亞型產生K249R的改變[14]。既往研究表明，其改變可能引起caspase-7 β亞型mRNA的相對表達量升高[15-16]，從而導致凋亡減弱，滑膜細胞增生，參與RA的發病。

綜上所述，在RA患者組與健康對照組中，caspase-7 β亞型基因rs2227309基因型分布具有差異，這可能是通過引起caspase-7非功能亞基的相對表達量升高，而導致滑膜細胞凋亡減弱，參與RA的發病。目前國內尚無caspase-7基因多態性與RA的相關性研究。我們可以通過進一步檢測中國地區RA患病者caspase-7 β亞基的含量進而探討其在RA發病中的作用。同時，我們也可以通過檢測caspase-7在凋亡通路中上游或者下游分子成分的改變，明確凋亡對于RA發病的具體作用。從而為探討RA的發病機制，對其進行早期預防、早期診斷、早期治療提供新的思路。

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Geneticpolymorphismofcaspase-7isoformβinpatientswithrheumatoidarthritis

JIANG Yu-fei, SHEN Bo, JIN Xiang, CHEN jia-xi, ZHU Min

(DepartmentofClinicalLaboratory,TaizhouHospital,WenzhouMedicalCollege,Taizhou317000,China.E-mail:shenbkz@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the association between the rs2227309 polymorphism of cysteinyl aspartate-specific protease-7 (caspase-7) isoform β and the genetic susceptibility in rheumatoid arthritis (RA) patients in Taizhou of China.METHODSGenotyping of rs2227309 of caspase-7 isoform β gene was performed in 204 RA patients and 203 matched healthy controls using TaqMan single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping assays.RESULTSThe genotype frequencies of GG, AG and AA of caspase-7 polymorphism in the RA patients were 33.3%, 53.4% and 13.2%, respectively, and 33.0%, 44.3% and 22.7% in the healthy individuals,respectively. There was a significant difference in caspase-7 genotype frequencies between the RA patients and healthy controls (Plt;0.05). The frequency of GG+AG genotype in RA patients was higher than that in healthy controls with significant difference (Plt;0.05, OR=1.921, 95%CI: 1.140～3.236). The frequencies of the G allele were 60.0% and 55.2% in the RA patients and the healthy individuals,respectively. No significant difference was observed in allele frequency between the RA patients and healthy controls (Pgt;0.05, OR=1.221, 95%CI: 0.924～1.613).CONCLUSIONThe rs2227309 polymorphism of caspase-7 isoform β gene is associated with the susceptibility to rheumatoid arthritis. The high production of the non-functional variant of caspase-7 may reduce the apoptosis of rheumatoid synovial cells, indicating the mechanism of this association.

Caspase-7 isoform β; Genetic polymorphism; Arthritis,rheumatoid

1000-4718(2011)12-2368-04

R593.22

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.024

2011-08-10

2011-10-13

浙江省科技廳公益技術社會發展項目(No.2010C33001)；臺州市科技計劃(No.102KY09)

△通訊作者 Tel: 0576-85199345 ; E-mail：shenbkz@yahoo.com.cn