p53靶位基因Wig-1——腫瘤與干細胞新的調控因子

曾 英(綜述)，肖華亮(審校)

(第三軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所病理科，重慶400042)

抑癌基因p53通過修復損傷DNA和抑制癌基因激活發揮抑制腫瘤發生的功能，激活p53使細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡［1，2］。p53人類腫瘤中突變頻率達50%［3］。p53發揮抑瘤功能主要是作為轉錄因子調節其靶位基因的表達，因此深入研究p53靶位基因的功能對完全闡明p53的功能是至關重要的。Wig-1(wild-type p53-induced gene 1)是p53基因的靶位基因之一，野生型p53可以激活Wig-1誘導細胞凋亡，研究發現Wig-1作為p53信號通路下游分子具有重要功能，闡明Wig-1的功能對于全面理解p53信號通路具有重要意義。

1 Wig-1蛋白的結構和功能特征

Wig-1，也叫 PAG608 或ZMAT3，是最早作為 p53的轉錄調節的直接靶位基因發現的。小鼠的 Wig-1是在J3D小鼠T淋巴瘤細胞(帶有溫度敏感的Val135突變p53元件)中發現的［4，5］。另一個實驗室用相似的方法在小鼠髓細胞性白血病細胞系LTR6克隆出同樣的基因，命名為PAG608［6］。后來不同的研究小組克隆了人 Wig-1，并證實 Wig-1是 p53的靶位基因［7，8］。人 Wig-1 8 kb 和6 kb 轉錄本在結腸癌細胞系HCT116和LoVo(帶有野生型TP53)表達上調，但是在缺少野生型TP53的DLD1細胞系中表達不上調，說明p53能夠誘導Wig-1表達。野生型p53使Wig-1的mRNA和蛋白水平表達上調，過表達Wig-1基因可以抑制腫瘤細胞的生長，表明Wig-1基因可能在依賴p53的生長調控途徑中起作用。

Wig-1位于人染色體3q26．32，全長2432 bp，及6個外顯子，包含870 bp的開放性閱讀框，其蛋白結構存在2種亞型，兩者僅差別一個氨基酸，Wig-1開放閱讀框包含288或289氨基酸，開放閱讀框后面帶有包含3個polyA的3'UTR，大約長8 kb。Wig-1包含3個帶有Cys2His2鋅指結構蛋白及一個核定位信號。鋅指結構之間的組氨酸距離由5個氨基酸代替正常3～4個氨基酸，鋅指結構之間連接也是由56～75氨基酸代替大多數鋅指結構的6～8個氨基酸，這種鋅指結構極為罕見，是缺乏一致雙鏈RNA(doublestranded RNA，dsRNA)結合模序的dsRNA結合蛋白所共有的，這組dsRNA結合蛋白在結合特異性、結合緊密程度及結合跨越空間上均具有較強的靈活性。現在研究最為清楚的dsRNA結合蛋白是JAZ，JAZ結合dsRNA核輸出受體Exportin-5［9］，通過結合p53蛋白從而正向調節 p53轉錄活性［10］。像 JAZ一樣，Wig-1也是一種RNA結合蛋白，它可結合＞50 bp的dsRNA，也可以結合單鏈RNA和RNA-DNA雜交分子，但是dsRNA是其最佳靶位［11］。第一鋅指結構和第二鋅指結構對于結合 dsRNA 是必需的［11，12］。Wig-1也可以結合大約21 bp的短鏈RNA，但僅是這些類似microRNA(miRNA)的小RNA。Dicer是一種對miRNA成熟至關重要的核糖核酸酶Ⅲ，Wig-1在缺失Dicer的胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES細胞)中表達下調，這提示Wig-1可能具有和miRNA相關的功能［13］。

Wig-1在結構上從魚類到人類都是保守的，特別是鋅指結構部分幾乎完全保守［14］。人和小鼠在蛋白質水平有87%同源，除了第三個鋅指結構中一個氨基酸置換外，其余鋅指結構均保持一致，同時鋅指結構之間的距離也是保守的［14］。

2 Wig-1的表達與調控

Wig-1的表達極為廣泛［7］，幾乎在所有檢測的組織中均有Wig-1表達，但在腦組織中表達水平最高，BioGPS(http://biogps．gnf．org)表達數據也證實Wig-1在所有組織表達基礎水平，在腦組織特別是在杏仁核和額葉前皮質表達水平最高，在平滑肌、心肌細胞、脂肪細胞表達水平較高。

人Wig-1在內含子1含有功能性的p53反應元件，小鼠Wig-1啟動子區域內包含2個功能性的p53結合位點，說明 p53 可以直接調節 Wig-1［5，8］。3 個研究小組證實Wig-1是p53靶位基因［4-8］，芯片數據也顯示使用小分子RITA激活p53以后，Wig-1表達上調［15］。此外，使用化療藥物氟尿嘧啶處理造血干細胞后引起DNA損傷，也可誘導Wig-1表達，這些均證明 Wig-1受 p53的調控［16］。

但是，同樣也觀察到在缺乏p53的細胞中，Wig-1仍維持較高水平，說明p53并不是調節Wig-1表達的唯一轉錄因子。通過數據庫(pscan:http://159．149．109．9/pscan/和 genomatix:http://www．genomatix．de)搜索，根據搜索數據庫和搜索參數的不同，得到Wig-1啟動子區域包含45～130個假定轉錄因子結合位點的結果，包括Myf5(myogenic factor 5)、FEV(fifth ewing variant，)、SPI1(spleen focus forming virus proviral integration oncogene)、Spz1(spermatogenic leucine zipper 1)、Pou5f1(POU class 5 homeobox 1)、GABPA(GA-binding protein alpha)、TP53、Nr2e3(nuclear receptor subfamily 2，group E，member 3)、Sox2(sex-determining region Y-box 2)、HLF(hepatic leukemia factor)等轉錄因子結合位點，這表明Wig-1接受多種轉錄因子嚴密調控。根據Pscan預測，p53是人和小鼠Wig-1候選轉錄因子排名最靠前的，可結合到Wig-1啟動子區域，這和前面的實驗結果一致［4-7］。根據預測的Wig-1轉錄因子譜，發現Wig-1在多種組織(肌肉、大腦、晶狀體、造血干細胞、ES細胞)中表達，受到復雜的調節，這與檢測到Wig-1在多種組織廣泛表達一致。根據Pscan預測，發現Wig-1既能被抑瘤基因p53又能被一些促進細胞生長和具有癌基因特征的轉錄因子，如spz1、Pou5f1和SPI1激活，表明Wig-1可在不同的細胞環境下誘導表達。另外，Wig-1候選轉錄因子(如Pou5f1和Sox2)對ES細胞生存至關重要，說明Wig-1可能是ES細胞一個新的調節因子。

為進一步研究上游調節信號通路對Wig-1表達的調控，對調控Wig-1的候選轉錄因子進行基因功能分類(gene ontology classifications:http://www．pantherdb．org)分析，結果顯示這些轉錄因子參與了白細胞介素、胰島素/胰島素樣生長因子、轉化生長因子β、血小板源性生長因子、氧化性應激、Ras、Toll-受體、凋亡、Wnt、趨化因子和細胞因子介導的炎癥、p53調控環路等信號通路，表明Wig-1參與了多種細胞活動過程。這些轉錄因子與重要的促進生長的信號通路相關，還有些信號通路跟Wig-1在p53網絡中的作用一致，如氧化應激反應、凋亡及p53反饋環路。根據以上信號通路分析發現，p53確實是Wig-1上游重要的激活子。總之，多種轉錄因子參與的信號可激活Wig-1，而不管p53表達與否，但是DNA損傷后Wig-1的表達需要有功能的p53。

3 Wig-1的功能

研究顯示，外源性表達Wig-1可長期抑制細胞生長，但不影響細胞周期分布和細胞死亡;而使用小干擾RNA降低Wig-1表達，也可導致細胞活性下降，這表明Wig-1表達過低或者過高都不利于細胞生長。使用質譜分析法鑒定Wig-1相互作用的蛋白，發現RNA解旋酶A(RNA helicase)和不均一核糖核酸核內核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，hnRNPA2/B1)以依賴 RNA的方式結合到 Wig-1［17］，然而這兩個蛋白均為多功能RNA結合蛋白，因此很難從這些RNA依賴的相互作用中單獨鑒定Wig-1的功能。與hnRNPA2/B1調節mRNA穩定性一樣，研究發現，Wig-1通過結合p53 mRNA的3'UTR的富含尿嘧啶(U)區，穩定 p53 mRNA，正向調節p53 mRNA，形成正向調節反饋環路。AREs由AUUUA組成或者連續幾個U組成，富含U區是AREs元件的一個子類，出現在8%的轉錄組中特定mRNA的3'UTR［18］，調節mRNA穩定性和翻譯，使這些基因的mRNA表達得到精細調控，包括可調節細胞生長或對外部因子作出細胞反應的基因，如 c-Myc、N-Myc、細胞周期調節蛋白、干擾素、p53及 p21［19，20］。AREs一般是負向調節基因表達，通過增加脫腺苷化作用促進mRNA降解，脫腺苷作用是mRNA降解的第一步也是限速步驟，同時加快mRNA衰變。AREs也可以降低翻譯效率。大部分結合和調節AREs的因子通過促進mRNA降解和抑制翻譯負向調節靶位mRNA［21］。然而也有主要表現為正向調節作用的AREs，如廣泛表達的人抗原R，AREs調節子根據所結合的mRNA表現為正向或者負向調節作用［22］。

ARE結合蛋白(ARE-binding proteins，ARE-BPs)能在細胞水平調控多種mRNA，因此被認為是重要的調節點［20］。p53基因的3'UTR包含一個富含尿嘧啶U區域(連續18個U)和另一個ARE［23］，兩者均被幾個ARE-BPs調節。Wig-1結合到p53 mRNA，通過阻止mRNA脫腺苷作用穩定mRNA［24］，這增加p53蛋白質水平，增強p53對DNA損傷反應。另有研究表明，抑制Wig-1同源類似物PAG608引起依賴p53的誘導細胞死亡作用減弱。大部分ARE-BPs調節多種mRNAs，研究也顯示Wig-1可以靶向除p53以外的其他包含ARE的mRNA。

4 Wig-1在腫瘤疾病、非腫瘤性疾病及干細胞中的研究

4．1 Wig-1與腫瘤 Wig-1在多種腫瘤細胞系及不同組織來源的原代細胞中均表達，但Wig-1在不同的腫瘤細胞系和腫瘤組織中表達水平不一致(來自http://biogps．gnf．org)。例如在 HCT116、SKOV-3、HT-29、HEK293、MCF7、T3M4、SN12C 表達降低;而在HeLa、HT1080、Jurkat、SHSY-5Y、U2OS、UACC62、SKMEL5、LNCAP表達升高。乳頭狀甲狀腺癌較正常組織表達升高，鱗狀細胞癌與正常組織表達差異不明顯，乳腺浸潤性導管癌及乳腺浸潤性小葉癌中表達均下降。

Wig-1位于染色體3q26．32區域，該區域在頭頸、乳腺、卵巢、宮頸、前列腺、食管、鼻咽、肺鱗狀細胞癌及急性髓細胞樣白血病中均有擴增，這表明Wig-1在這些腫瘤中也可能擴增，也有實驗證實Wig-1在肺癌中過表達［7］。然而，Wig-1所在的染色體區域也存在幾個腫瘤相關的基因，如端粒酶RNA元件和Bcl-6，所以Wig-1是單基因擴增還是作為伴隨基因共擴增仍需要進一步研究。此外，Wig-1能同時被腫瘤抑制基因(如p53)和具有癌基因活性的轉錄因子激活，研究中也發現過表達 Wig-1和降低Wig-1表達均可抑制細胞生長，而在腫瘤組織中Wig-1表達升高和降低均有報道，因此，就目前的研究還不足以界定Wig-1是抑瘤基因還是癌基因，需要深入研究Wig-1在腫瘤中的功能。

4．2 Wig-1與非腫瘤性疾病 研究發現，大鼠Wig-1的類似物PAG608在大鼠神經系統不同區域均表達相對較高的水平，在局部缺血、使用甲基苯丙胺處理大鼠、肌萎縮性側索硬化癥模型的早期、Parkinson疾病模型，均可誘導Wig-1表達。另外也有研究顯示，PAG608在大腦處于應激作用下發揮預凋亡(pro-apoptotic)功能。總的來說，Wig-1/PAG608可在神經系統應激反應和病理條件下發揮作用。

4．3 Wig-1與干細胞 在干細胞中Wig-1表達升高。比較造血干細胞、神經干細胞、ES細胞及與之相應的分化細胞表達，研究發現Wig-1在三種干細胞中表達水平較分化細胞高表達［25］。Bmi-1是維持造血干細胞自我更新的一個必需因子，在缺失Bmi-1癌基因的造血干細胞，Wig-1表達上調［26］，與此同時伴隨成體造血干細胞丟失，這是由于Wig-1表達水平升高促進造血干細胞丟失，還是缺失Bmi-1后所發生的代償機制，這仍需進一步研究。此外，Wig-1在紅細胞生成過程中表達下調，這與Wig-1維持造血干細胞和造血祖細胞干性功能一致。

另外，生物芯片研究結果證實Wig-1在生殖細胞和ES細胞中發揮作用。例如，使用神經膠質細胞源性神經元營養因子和神經膠質細胞源性神經元營養因子家族受體α1刺激精原干細胞可誘導Wig-1表達［27］。這些研究表明，生長因子刺激干細胞以后誘導Wig-1表達。與Wig-1在干細胞中的作用一致，Wig-1在受精前的小鼠卵母細胞低水平表達，這種水平維持至E4．5胚胎表達升高。觀察到使用shRNA干擾Wig-1的表達以后，降低干細胞表型，表明Wig-1能維持胚胎干細胞干性［28］，生物信息學也預測Wig-1候選轉錄因子包含2個ES細胞必需轉錄因子Pou5f1和Sox2。

5 存在的問題

p53靶位基因Wig-1參與基因轉錄后水平調節，表明p53及其下游靶位Wig-1所參與一個全新的基因調節，p53除了直接轉錄靶位，還在mRNA水平調節不同的靶位［29］，p53通過調節mRNA的穩定性或者翻譯，精細調節其轉錄靶位。然而，仍需解決以下問題:鑒定Wig-1新的靶位及調控Wig-1的轉錄因子;確切闡明Wig-1功能及Wig-1發揮功能的具體機制，Wig-1是否能參與重編程，使成體細胞恢復干細胞特性;Wig-1在腫瘤干細胞中的表達如何?是否也參與維持腫瘤干細胞的自我更新和分化?只有解決這些問題才能全面闡明Wig-1在轉錄后水平調節基因表達和細胞生物學功能。

6 結語

隨著研究的深入，越來越凸顯p53調節網絡的復雜性。p53有除細胞周期調控和應激條件下誘導細胞凋亡功能以外，還有調節細胞新陳代謝的作用，低基礎水平的可促進細胞存活，p53靶位基因Wig-1正好具有這些功能，Wig-1誘導細胞周期阻滯或凋亡，并且在翻譯后水平調節基因表達。Wig-1在所有真核細胞生物結構保守，因此Wig-1對維持細胞的基本活動和調控細胞命運具有重要作用。然而，Wig-1的功能及生物學意義的研究才剛剛起步，還需要更多、更深入的研究，才能完全闡明其功能和生物學意義。

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