p38絲裂素活化激酶與腦缺血性損傷關(guān)系的研究進(jìn)展

顧瑩輝，劉宏順，戴海琳，馮姍姍（綜述），馮雪丹（審校）

（保定市第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北保定 071000）

絲裂素活化激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞信息傳遞共同通路［1］。MAPK被激活后，可使核轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白激酶等多種底物磷酸化，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過程，并在細(xì)胞凋亡、惡性轉(zhuǎn)化等病理過程中起重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)至少4種類型的MAPK途徑在不同的生物反應(yīng)中發(fā)揮作用。其中，p38 MAPK不僅在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用，還參與細(xì)胞存活、分化和發(fā)育的過程［1］。

1 p38 MAPK的生物學(xué)特性

p38 MAPK 是1993年 Lennmyr等［2］發(fā)現(xiàn)的1種由360個(gè)氨基酸組成的酪氨酸磷酸化蛋白激酶，與釀酒酵母促分裂原蛋白激酶系統(tǒng)有同源性。目前已克隆出6種p38 MAPK亞型，分別是 p38α1、p38α2、p38β1、p38β2、p38γ、p38δ，p38 MAPKα 和 p38 MAPKβ在人類普遍表達(dá)，p38 MAPKγ主要在肌肉中表達(dá)，p38 MAPKδ主要在腺組織中表達(dá)。各亞型有許多相似之處，但這些激酶的上游激酶、下游底物及對(duì)不同p38 MAPK抑制劑SB203580反應(yīng)不盡相同。因此，不同p38 MAPK的異構(gòu)體對(duì)同一刺激有不同反應(yīng)，不同的p38 MAPK信號(hào)通路在不同細(xì)胞中介導(dǎo)不同生物效應(yīng)。

目前認(rèn)為p38信號(hào)通路模式為促炎因子，如腫瘤壞死因子 α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）1及缺血/再灌注、高滲環(huán)境、熱損傷、過氧化氫等應(yīng)激刺激均可通過某種中間環(huán)節(jié)，激活絲裂原活化蛋白激酶激酶5，轉(zhuǎn)而激活絲裂原活化蛋白激酶激酶3/6，使p38“T環(huán)結(jié)構(gòu)”Thr-Gly-Tyr上的Thr（酪氨酸）和Tyr（蘇氨酸）雙位點(diǎn)磷酸化，p38被激活。激活的p38可進(jìn)入細(xì)胞核或轉(zhuǎn)移到其他部位，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子2/6、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2、核轉(zhuǎn)錄因子β、生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)153、ETS樣蛋白1和突觸相關(guān)蛋白1等［3，4］，上述許多轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)參與細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子 α、IL-1、IL-6、IL-8、血管細(xì)胞黏附分子1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等的基因表達(dá)［5］。除此之外，p38還能激活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白和一些蛋白激酶（絲裂原活化蛋白激酶激活蛋白2/3、p38調(diào)節(jié)/激活蛋白激酶、MAP激酶相互作用蛋白激酶1/2、有絲分裂原和被激活的蛋白質(zhì)激酶1/受體蛋白激酶、核糖體S6蛋白激酶B等）。一些被磷酸化的激酶能進(jìn)一步磷酸化低分子熱休克蛋白，從而介導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)，調(diào)控細(xì)胞的分化、凋亡及多種細(xì)胞反應(yīng)。

2 p38 MAPK在腦缺血損傷中的表達(dá)

各種腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ途C實(shí)，p38 MAPK在腦缺血后早期被激活，缺血區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元表達(dá)增加，并表現(xiàn)出時(shí)間相關(guān)性，提示信號(hào)通路在腦缺血神經(jīng)元死亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Sugion等［6］在沙土鼠短暫前腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)腦缺血后5 min海馬CA1區(qū)的p38活性即升高，再灌注15 min達(dá)峰值，后逐漸減少至消失。CA3區(qū)激活的p38活性在再灌注15 min時(shí)也升高，峰值在6 h出現(xiàn)，后逐漸減少，在12 h仍可檢測(cè)到，缺血前注射SB203580可減少CA3區(qū)細(xì)胞死亡。Piao等［7］用沙土鼠制備全腦短暫缺血?jiǎng)游锬Ｐ停l(fā)現(xiàn)p38α和p38β在海馬區(qū)表達(dá)增強(qiáng)，p38α活性在缺血后第2天達(dá)到高峰，此后其活性逐漸下降，而p38β活性表現(xiàn)為遲發(fā)性和漸進(jìn)性升高，p38β在缺血后第2天開始升高，在第4天時(shí)達(dá)到高峰，為對(duì)照組的2．9倍，并且此后幾天能持續(xù)保持相同水平。p38α主要在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，p38β主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。

3 p38 MAPK在腦缺血損傷中的作用

3．1 炎性反應(yīng) 在體內(nèi)和體外，p38既可被多種促炎細(xì)胞因子活化，啟動(dòng)后續(xù)的細(xì)胞炎性反應(yīng)，還參與介導(dǎo)其他胞外信號(hào)引起的炎性細(xì)胞因子或炎性產(chǎn)物的表達(dá)和釋放［8］。促炎的p38路徑在細(xì)胞受到應(yīng)激的早期發(fā)揮保護(hù)作用，但其進(jìn)一步活化就會(huì)致使炎性細(xì)胞因子持續(xù)高水平表達(dá)，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷和功能障礙。Lennmyr等［2］在腦缺血核心區(qū)的巨噬細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)活化的p38 MAPK，提示p38可能參與腦缺血損傷時(shí)的炎性反應(yīng)。St-Denis等［9］用脂多糖刺激大鼠巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK磷酸化，抑制這一步磷酸化可減輕甚至完全阻斷巨噬細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子α的產(chǎn)生，說明炎性反應(yīng)中腫瘤壞死因子α的產(chǎn)生與p38 MAPK激活密切相關(guān)。

3．2 自由基損傷 腦缺血/再灌注后造成的缺氧/高氧現(xiàn)象可以觸發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激級(jí)聯(lián)反應(yīng)。氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化可引起細(xì)胞成分脂質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互交聯(lián)，損傷神經(jīng)元功能，還可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血栓形成。

MAPK的4個(gè)家族對(duì)活性氧簇非常敏感，體內(nèi)體外試驗(yàn)均能證明活性氧可激活p38 MAPK通路，引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化或調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因而誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。自由基清除劑乙酰半胱氨酸能顯著抑制MAPK信號(hào)通路［10］。還原型輔酶Ⅱ氧化酶抑制劑和過氧化氫酶的過表達(dá)可阻斷AngⅡ參與的p38 MAPK磷酸化。

3．3 凋亡 缺血性腦損傷后大量神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性凋亡。p38 MAPK信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Walton等［11］在沙土鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈堵塞7 min全腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)磷酸化激活的p38在觀察的47 d內(nèi)均表達(dá)出高水平，高峰出現(xiàn)在缺血后第4天，導(dǎo)致神經(jīng)元在1周左右發(fā)生凋亡樣細(xì)胞死亡。Maroney等［12］在沙土鼠腦缺血模型發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK及其底物轉(zhuǎn)錄因子2、絲裂原活化蛋白激酶活化的蛋白2在腦缺血后持續(xù)數(shù)天活化，缺血后3～4 d酶活性最高，同時(shí)海馬區(qū)錐狀神經(jīng)元同期缺損最多，抑制p38活性可以顯著抑制這些神經(jīng)元的凋亡現(xiàn)象。

腦缺血后恢復(fù)腦血流可加重缺血腦組織的死亡，這種再灌注損傷主要以凋亡為主。Legos等［13］和Schauer等［14］研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK 的激活是再灌注損傷引起凋亡的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。p38 MAPK位于胞質(zhì)內(nèi)，被激活后進(jìn)一步活化下游的轉(zhuǎn)錄因子、絲裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶2，3及caspase家族成員。磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件相結(jié)合，引起大量與凋亡有關(guān)的基因表達(dá)，與細(xì)胞延遲性死亡關(guān)系密切［15］。MAPK信號(hào)途徑激活后啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的詳細(xì)機(jī)制，尤其是轉(zhuǎn)錄水平對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控仍未完全闡明。

4 p38 MAPK特異性抑制劑的神經(jīng)保護(hù)作用

p38 MAPK的特異性抑制劑是一類吡啶異咪噠唑化合物，包括 SB203580、SB2021090、SB206718、SK＆F86002和VK-19911等。這些抑制劑與p38結(jié)合，其側(cè)翼的氟苯環(huán)伸入結(jié)合口袋中，并與結(jié)合口袋中的10個(gè)疏水性氨基酸以范德華力作用，使p38 MAPK失去與三磷酸腺苷結(jié)合的能力而失去激酶活性。最近，新一代的p38選擇性抑制劑SB239063被確切地描述。SB239063以40 nmol/L的50%抑制濃度抑制p38的α和β亞型。相對(duì)于其他激酶包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、氨基末端激酶1和蛋白激酶Cα來說，SB239063對(duì)p38的選擇性比目前常用的p38選擇性抑制劑 SB203580要高2000倍［16］。SB239063能較好地通過血腦屏障，而對(duì)腦血流量、血流動(dòng)力學(xué)及體溫?zé)o影響。近年來，合成可供口服的特異性p38 MAPK抑制劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明能有效地抑制p38 MAPK 活性，且有很好的生物利用度［17，18］。

Legos等［19］在大鼠大腦中動(dòng)脈線栓模型前1 h及大鼠大腦中動(dòng)脈線栓模型后6 h給予口服不同劑量的SB239063，24 h后觀察梗死體積及神經(jīng)元缺損情況，發(fā)現(xiàn)SB239063有顯著的劑量依賴性神經(jīng)保護(hù)作用，并可明顯減少梗死體積和神經(jīng)元的缺損。

p38 MAPK抑制劑的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚無定論，可能為:① 減輕炎性反應(yīng)。SB239063能夠顯著地抑制炎性細(xì)胞因子（如IL-1和腫瘤壞死因子［14］）的產(chǎn)生，從而抑制這些因子對(duì)炎性細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)、聚集、活化和脫顆粒的促進(jìn)作用。目前認(rèn)為，這種特異性抑制劑在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩個(gè)水平上都發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。②抑制細(xì)胞凋亡。通過抑制p38 MAPK通路可顯著減少大鼠腦缺血后海馬C1區(qū)的凋亡神經(jīng)元［20］。p38 MAPK抑制劑SB203580可抑制清除神經(jīng)生長(zhǎng)因子導(dǎo)致的大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株細(xì)胞凋亡。③抑制性氨基酸的細(xì)胞毒作用。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中，有效濃度的SB239063對(duì)輕至中度的興奮性氨基酸細(xì)胞毒作用具有保護(hù)效果。④ 減輕自由基損傷。SB203580可以阻斷一氧化氮通過刺激Bax流入線粒體而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡的過程。⑤減輕腦水腫。減少水通道蛋白4、水通道蛋白29的表達(dá)，減輕腦缺血后的腦水腫。⑥直接的神經(jīng)保護(hù)作用。在培養(yǎng)的大鼠腦組織中，SB239063對(duì)缺氧、葡萄糖缺乏等類似缺血的情況表現(xiàn)出直接的神經(jīng)保護(hù)作用。

但也有少數(shù)學(xué)者持不同意見，Lennmyr等［21］制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型，術(shù)前右側(cè)腦室內(nèi)注射SB203580并用磁共振成像檢測(cè)腦缺血性損傷體積和血腦屏障破壞情況，研究發(fā)現(xiàn)缺血后1 d，SB203580干預(yù)組梗死體積比對(duì)照組顯著增大，血管釓漏出（提示血腦屏障破壞）比對(duì)照組顯著增多。因此，認(rèn)為SB203580可能加重腦缺血損傷和增加血管通透性［22］。

5 展望

缺血性腦損傷的病理生理機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，針對(duì)其中某一種或幾種進(jìn)行干預(yù)，往往達(dá)不到預(yù)期目的。近幾年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外信號(hào)數(shù)量眾多，但進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的通路卻為數(shù)較少。在其中關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平進(jìn)行阻斷和調(diào)控，有望成為特效或高效治療的切入點(diǎn)。p38 MAPK信號(hào)通路在缺血后腦損傷的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，成為研究的靶點(diǎn)。p38 MAPK抑制劑的研究尚處于初級(jí)階段，新一代抑制劑的臨床效果及對(duì)人體正常生理功能有無影響等問題有賴于大量實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

［1］Johnson GL，Lapadat R．Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK，JNK and p38 protein kinase［J］．Science，2002，298（5600）:1911-1912．

［2］Lennmyr F，Karlsson S，Gerwins P，etal．Activation ofmitogen-activated protein kinases in experimental cerebral ischemia［J］．Acta Neurol Scand，2002，106（6）:333-340．

［3］Brewster JL，de Valoir T，Dwyer ND，etal．An osmosensing signal transduction pathway in yeast［J］．Science，1993，259（5102）:1760-1763．

［4］Lee JC，Kumar S，Griswold DE，etal．Inhibition of p38 MAP kinase as a therapeutic strategy［J］．Immunopharmacology，2000，47（2/3）:185-201．

［5］Ferrer I，F(xiàn)riguls B，DalfóE，etal．Earlymodifications in the expression ofmitogen activated protein kinase（MAPK/ERK），stressactivated kinases SAPK/JNK and p38，and their phosphorylated substrates following focal cerebral ischemia［J］．Acta Neuropathol，2003，105（5）:425-437．

［6］Sugion T，NozakiK，TakagiY，etal．Activation ofmitogen-activated protein kinases after transient forebrain ischemia in gerbil hippocampus［J］．JNeurosci，2000，20（12）:4506-4514．

［7］Piao CS，Che Y，Han PL，etal．Delayed and differential induction of p38MAPK isoforms inmicroglia and astrocytes in the brain after transient global ischemia［J］．Brain Res Mol Brain Res，2002，107（2）:137-144．

［8］Koistinaho M，Koistinaho J．Role of p38 and p44/42mitogen activated protein kinases in microglia［J］．Gila，2002，40（2）:175-183．

［9］St-Denis A，Chano F，Tremblay P，etal．Protein kinase C-alpha modulates lipopolysaccharide-induced functions in a murine marcophage cell line［J］．JBiol Chem，1998，273（49）:32787-32792．

［10］LiWG，Coppey L，Weiss RM，etal．Antioxidant therapy attenuates JNK activation and apoptosis in the remote noninfarcted myocardiuMafter large myocardial infarction［J］．BiocheMBiophys Res Commun，2001，280（1）:353-357．

［11］Walton KM，DiRocco R，Bartlett BA，etal．Activation of p38MAPK in microglia after ischemia［J］．J Neurochem，1998，70（4）:1764-1767．

［12］Maroney AC，F(xiàn)inn JP，Bozyczko-coyne D，etal．GEP-134（KT7515），an inhibitor of JNK activation，rescues sympathetic neurons and neuronally differentiated PC12 cells froMdeath evoked by three distinct insults［J］．J Neurochem，1999，73（5）:1901-1902．

［13］Legos JJ，Mclaughlin B，Skaper SD，etal．The selective p38 inhibitor SB-239063 protects primary neurons froMmild tomoderate excitotoxic injury［J］．Eur JPharmacyol，2002，447（1）:37-42．

［14］Schauer RJ，Grebes AL，Voneir D，etal．Induction of cellular resistance against kuffer cell-derived oxidant stress:a novel concept of hepatoprotection by ischemic preconditioning［J］．Hepatology，2003，37（2）:286-295．

［15］Barone FC，Irving EA，Ray AM，etal．Inhibition of p38MAPKmitogen-activated protein kinase provides neuroprotection in cerebral focal ischemia［J］．Med Res Rev，2001，21（2）:129-145．

［16］Harper SJ，Wilkie N．MAPKs:new targets for neurodegeneration［J］．Expert Opin Ther Targets，2003，7（2）:187-200．

［17］Hunt JA，Kallashi F，Ruzek RD，etal．p38 Inhibitors:piperidineand 4-aminopiperidine-substituted naphthyridinoes，quinolinones，and dihydroquinazolinones［J］．Bioorg Med CheMLett，2003，13（3）:467-470．

［18］Stelmach JE，Liu L，Patel SB，etal．Design and Synthesis of Potent，orally bioavailable dihyroquinazolinone inhibitors of p38MAP kinase［J］．Bioorg Med CheMLett，2003，13（2）:277-280．

［19］Legos JJ，Erhardt JA，White RF，etal．SB239063，a novel p38 inhibitor，attenuates early neuronal injury following ischemia［J］．Brain Res，2001，892（1）:70-77．

［20］Dohi K，Mizushima H，Nakajo S，etal．Pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide（PACAP）prevents hippocampal neurons froMapotosis by inhibiting JNK/SAPK and p38 signal transduction pathways［J］．Regul Pept，2002，109（1/3）:83-88．

［21］Lennmyr F，Ericsson A，Gerwins P，etal．Increased brain injury and vascular leakage after pretreatment with p38-inhibitor SB203580 in transient ischemia［J］．Acta Neurol Scand，2003，108（5）:339-345．

［22］Cvetkovic I，Miljkovic D，Vuckovic O，etal．Taxol activates inducible nitric oxide synthase in rat astrocytes:the role of MAP kinases and NF-kappaB［J］．CellMol Life Sci，2004，61（10）:1167-1175．