移植肝缺血/再灌注損傷的研究進(jìn)展

何同梅（綜述），鄭智勇，武一曼（審校）

（1．福建中醫(yī)藥大學(xué)?？偨虒W(xué)醫(yī)院，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科，福州 350025;2．福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院病理學(xué)教研組，福州 350003）

移植肝相關(guān)的缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）也稱為保存性損傷，是指從供肝者心臟停跳開始到供肝植入受者體內(nèi)，重新建立起血液循環(huán)的全過程中在任何時(shí)間和任何環(huán)節(jié)發(fā)生的肝細(xì)胞損傷。在肝移植領(lǐng)域，IRI與早期移植肝的無功能和肝功能障礙密切相關(guān)，同時(shí)IRI也增加了移植物急慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，減少IRI可以大大提高移植成功率。因此，IRI一直是器官移植研究中的一個(gè)熱點(diǎn)?，F(xiàn)將對(duì)IRI的發(fā)生機(jī)制、病理形態(tài)特點(diǎn)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 IRI的發(fā)生機(jī)制

IRI的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)連續(xù)的過程，是許多相關(guān)因子聯(lián)合作用的結(jié)果，現(xiàn)按其病理生理學(xué)過程分為熱缺血損傷、冷保存損傷、復(fù)溫?fù)p傷和再灌注損傷四個(gè)過程。

1．1 熱缺血損傷 肝臟在離體到冷灌注開始的這段時(shí)間叫熱缺血期。這期間血流減少和氧缺乏直接導(dǎo)致細(xì)胞氧供的不足，線粒體呼吸鏈功能發(fā)生改變［1］，線粒體酶的氧化還原反應(yīng)受到抑制，使三磷酸腺苷合成減少，無氧酵解增多導(dǎo)致乳酸、酮體沉積，引起代謝性酸中毒。細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷的降低導(dǎo)致細(xì)胞膜離子交換紊亂，抑制了Na+-K+-三磷酸腺苷酶的活性，引起細(xì)胞內(nèi)Na+的蓄積，從而導(dǎo)致細(xì)胞的腫脹和壞死。細(xì)胞膜通透性的改變、Na+-Ca2+交換異常、酸中毒等導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增高，而鈣超載被認(rèn)為是引起不可逆損傷的決定性環(huán)節(jié)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣水平的增加可促使黃嘌呤脫氫酶向黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化，從而為氧自由基的產(chǎn)生提供了催化劑［2］。另外，庫普弗細(xì)胞的鈣超載是其被激活的原因之一，激活的庫普弗細(xì)胞可通過釋放大量毒性介質(zhì)參與或介導(dǎo)肝臟損傷［3］。

1．2 冷保存損傷 器官通過冷保存來降低代謝率，但同時(shí)低溫也會(huì)對(duì)器官組織的正常功能產(chǎn)生很大影響。經(jīng)研究表明［4］，冷缺血主要損傷非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞，如庫普弗細(xì)胞、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，其原因可能與熱缺血時(shí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶分解蛋白亢進(jìn)有關(guān)。肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷機(jī)制與熱缺血損傷類似。另外，在這一過程中供肝的核因子κB受到應(yīng)激并表達(dá)黏附因子、趨化因子、細(xì)胞因子等多種炎性介質(zhì)［5］。

1．3 復(fù)溫?fù)p傷 在切除患者病肝之后，供體肝臟拿到手術(shù)野進(jìn)行血管重建的時(shí)段里，供肝逐漸被復(fù)溫且酶的活性及代謝率提高，許多儲(chǔ)存的肝糖原被快速消耗，只能通過增加無氧糖酵解來滿足代謝的需求。無氧酵解產(chǎn)生更多乳酸及酮體使得酸中毒更加嚴(yán)重，因此，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重［6］。

1．4 再灌注損傷 當(dāng)血流再通后，肝細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，其機(jī)制主要與庫普弗細(xì)胞活化、內(nèi)皮細(xì)胞受損、白細(xì)胞激活及以上細(xì)胞引起的一系列應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

1．4．1 庫普弗細(xì)胞激活 隨著門靜脈血流的開放，庫普弗細(xì)胞被進(jìn)入肝臟的腸毒素進(jìn)一步激活，大量釋放氧自由基、多種炎性因子及細(xì)胞因子［7］。其中氧自由基產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物可以通過氧化漿膜使膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，還可以通過氧化核酸使DNA雙鏈斷裂直接損傷細(xì)胞。氧自由基還可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致微血管喪失完整性、血流量減少。腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是庫普弗細(xì)胞激活后釋放的最重要的細(xì)胞因子之一，持續(xù)增多的TNF-α可以促進(jìn)肝細(xì)胞壞死，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，并且誘導(dǎo)氧自由基的進(jìn)一步釋放和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）1、IL-6、IL-8 分泌增加，與其他細(xì)胞因子相互作用共同加重肝組織損傷［8］。血小板活化因子在肝臟再灌注12 h后明顯增加［9］，血小板活化因子通過增加TNF-α和細(xì)胞因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞化學(xué)趨化因子來活化中性粒細(xì)胞，可導(dǎo)致急性炎性反應(yīng);血管滲透壓的改變和血小板活化，提高促凝血物質(zhì)的活性，加重微循環(huán)障礙;血栓素A2合成增加可以使血小板聚集、血管收縮。以上都是庫普弗細(xì)胞激活對(duì)肝組織的損傷作用，而研究表明［10］，再灌注后庫普弗細(xì)胞的血紅素氧合酶1高表達(dá)有利于對(duì)抗白細(xì)胞聚集，減輕炎性反應(yīng)。同時(shí)其他的生物活性物質(zhì)（如包括磷脂酶A2、IL-10、地諾前列酮及白三烯等）均在加重肝損傷的同時(shí)也有正面調(diào)節(jié)作用。

1．4．2 內(nèi)皮細(xì)胞損傷 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞作為冷缺血過程中受損最嚴(yán)重的細(xì)胞［11］，是一個(gè)重要的IRI級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)因素，它被激活后表達(dá)一系列的表面黏附分子及主要組織相容性復(fù)合體抗原，使紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板黏附到內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，并且活化中性粒細(xì)胞。另外，缺氧和內(nèi)毒素刺激肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分泌內(nèi)皮素，內(nèi)皮素可以通過激活磷脂酶及細(xì)胞膜離子通道使收縮血管。同時(shí)具有舒張血管作用的一氧化氮減少，內(nèi)皮素與一氧化氮水平失衡又加重了微循環(huán)障礙［12］。

1．4．3 白細(xì)胞激活 中性粒細(xì)胞活化后可產(chǎn)生氧自由基、細(xì)胞因子直接或間接損傷肝細(xì)胞，中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附還可促進(jìn)肝微循環(huán)“無復(fù)流”現(xiàn)象產(chǎn)生，加重肝損傷。中性粒細(xì)胞的聚集也加重了微循環(huán)障礙。最近研究表明［13，14］，自然殺傷細(xì)胞、T 細(xì)胞和T細(xì)胞在肝IRI中也發(fā)揮著重要的作用，這些細(xì)胞釋放一系列細(xì)胞因子和趨化因子或通過抗原呈遞反應(yīng)相互作用，最終將導(dǎo)致更多的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集［7］。目前關(guān)于Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）的研究很多，但還沒有形成系統(tǒng)的理論。TLRs在天然免疫系統(tǒng)中有重要作用，主要在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上表達(dá)。許多研究［12-14］認(rèn)為，TLR-4的激活在 IRI中起重要作用，TLR-4受到激活后與配體結(jié)合進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)錄因子核因子κB及多種促炎因子（TNF-α、IL-8、細(xì)胞間黏附分子1等），從而引起肝細(xì)胞凋亡、壞死，而TLR-2和TLR-9也被認(rèn)為是與IRI相關(guān)的分子機(jī)制。

2 IRI的病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

IRI不同階段供肝的病理學(xué)損傷也不一樣。缺血期主要改變有肝細(xì)胞濁腫、變性。冷保存損傷主要是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞水腫、脫落，肝細(xì)胞進(jìn)一步水腫，隨著冷保存時(shí)間的延長，中央靜脈旁的肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死［15］。此外，還可以在肝小葉內(nèi)見到一些單一或聚集的嗜酸性顆粒，可能是肝細(xì)胞壞死后的崩解顆粒［16］。再灌注損傷是在熱缺血和冷保存損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加重的肝組織損傷，主要表現(xiàn)為靜脈周圍肝細(xì)胞的水樣/氣球樣變、膽汁淤積、肝細(xì)胞凋亡、肝竇內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤，不同程度的肝細(xì)胞脫失和壞死，匯管區(qū)炎癥輕微，無靜脈內(nèi)皮炎。

肝損傷修復(fù)反應(yīng)于移植后的2～3 d即可發(fā)生。輕度IRI的修復(fù)反應(yīng)常限于肝細(xì)胞有絲分裂、肝板增厚和細(xì)胞核體積增大。小葉中央肝細(xì)胞壞死經(jīng)常觸發(fā)鄰近Ⅱ帶區(qū)域肝細(xì)胞的有絲分裂，可迅速增殖并重建正常小葉或肝板結(jié)構(gòu)。嚴(yán)重IRI地修復(fù)反應(yīng)常會(huì)引起小膽管增生和門管區(qū)以及肝板結(jié)構(gòu)變形，這些改變通常持續(xù)1～2個(gè)月或更長的時(shí)間［15］。另外，IRI還激活了肝星形細(xì)胞，并造成了中央靜脈和匯管區(qū)纖維化［17］。

全國肝膽腫瘤及移植病理協(xié)作組2008年提出的移植肝IRI組織學(xué)分級(jí)［18］，按以下三個(gè)主要病理指標(biāo)進(jìn)行分級(jí)，其中最嚴(yán)重的一項(xiàng)作為分級(jí)依據(jù)。①肝細(xì)胞水樣/氣球樣變:按累及面積分為3級(jí)，0級(jí):無;輕度:﹤ 30%;中度:30%～50%;重度:﹥50%。②肝細(xì)胞膽汁淤積:同上。③肝細(xì)胞壞死:按累及面積分為3級(jí)，0級(jí):無;輕度:﹤3個(gè)肝細(xì)胞的點(diǎn)狀壞死;中度:3～5個(gè)肝細(xì)胞的灶性壞死;重度:﹥5個(gè)肝細(xì)胞的融合性/帶狀壞死。

3 IRI的預(yù)防及治療

3．1 IRI的預(yù)處理 目前主動(dòng)預(yù)防是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，主動(dòng)預(yù)防主要是預(yù)處理，即通過觸發(fā)機(jī)體組織產(chǎn)生內(nèi)源性抗損傷機(jī)制而發(fā)揮臟器保護(hù)作用，主要有以下兩種不同的預(yù)處理方式。

3．1．1 肝臟缺血預(yù)處理 肝臟缺血預(yù)處理（ischemia preconditioning，IPC）是指組織或器官在經(jīng)過短暫的缺血后，能啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，增加其對(duì)隨后持續(xù)性缺血的耐受性。目前，對(duì)于IPC的研究大多處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，國外有報(bào)道部分應(yīng)用于臨床，但其效果并不一致。一些研究表明［19-21］，IPC具有減輕IRI的作用，有臨床意義。而 Testa等［22］研究認(rèn)為，實(shí)施缺血預(yù)處理組和未實(shí)施缺血預(yù)處理組的器官保護(hù)作用沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以認(rèn)為無臨床意義。

IPC的保護(hù)性作用機(jī)制還沒有完全研究清楚，可能通過以下一系列內(nèi)源性機(jī)制減輕由IRI造成的損害。①IPC可抑制庫普弗細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗氧自由基，從而減輕由氧自由基引起的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷。②IPC可抑制庫普弗細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α等多種細(xì)胞因子，從而在起始階段阻止多種細(xì)胞因子的釋放。同時(shí)還可激活血紅素加氧酶1，從而抑制IL-1的表達(dá)，減少轉(zhuǎn)錄因子核因子κB與細(xì)胞核結(jié)合，增加細(xì)胞抗氧化能力。③IPC可抑制肝竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)黏附分子、細(xì)胞間黏附分子1和巨噬細(xì)胞分化抗原1，從而減少中性粒細(xì)胞的黏附、游走和激活，進(jìn)而保護(hù)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。④IPC可激活腺苷A2A受體，刺激一氧化氮合酶的產(chǎn)生，增加一氧化氮的產(chǎn)生，使一氧化氮與內(nèi)皮素重新趨向平衡。⑤IPC還可以通過腺苷和緩激肽等激活細(xì)胞膜受體，進(jìn)而激活蛋白激酶C、p38絲裂原活化蛋白激酶等介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［23］。目前認(rèn)為蛋白激酶C和p38絲裂原活化蛋白激酶可維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，防止細(xì)胞凋亡。

3．1．2 藥物性預(yù)處理 用藥物替代缺血誘導(dǎo)對(duì)肝臟的保護(hù)作用。由于該法的安全閾大，無需其他特殊儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單、便于臨床推廣和應(yīng)用，所以研究前景很大，但目前大多處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段。相關(guān)藥物主要是抗氧化劑、腺苷受體激動(dòng)劑、一氧化氮、能量代謝調(diào)節(jié)劑、抑制中性粒細(xì)胞激活的黏附劑、細(xì)胞保護(hù)因子等［24］。多種藥物混合使用是藥物性預(yù)處理的發(fā)展方向［25］。

3．2 IRI的治療 目前對(duì)于IRI的治療還沒有一項(xiàng)有確定療效的治療方案，但是相關(guān)的臨床和試驗(yàn)室研究都很多。氨基酸類的藥物有甘氨酸、N-乙酰半胱氨酸等［26］，減少氧自由基的藥物包括抗氧化劑、一氧化氮、一氧化碳等，減輕炎性反應(yīng)的藥物有前列環(huán)素、阿托品、糖皮質(zhì)激素等［27］。另外，在分子水平、基因水平的動(dòng)物試驗(yàn)性研究也很多，如干擾素調(diào)節(jié)因子、IL-10、程序性死亡因子、Bcl-6、Fas基因等。

4 結(jié)語

IRI一直是困擾肝臟移植的難題，近年來這方面的研究雖然取得了很大進(jìn)展，但大多處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，人類臨床試驗(yàn)仍相對(duì)較少，并面臨很多問題，如IPC的最佳復(fù)灌-缺血時(shí)間、用藥劑量及時(shí)間是否符合倫理等。但是，隨著對(duì)肝臟IRI的機(jī)制研究的不斷深入，針對(duì)肝臟IRI具體機(jī)制的各個(gè)環(huán)節(jié)/靶點(diǎn)尋求幾種方法相結(jié)合的綜合防治措施將是未來研究的主要方向。

［1］Lemasters JJ，Theruvath TP，Zhong Z，etal．Mitochondrial calciuMand the permeability transition in cell death［J］．BiochiMBiophys Acta，2009，787（11）:1395-1401．

［2］Sato H，Takeo T，Liu Q，etal．Hydrogen peroxide mobilizes Ca2+through two distinctmechanisms in rat Hepatocytes［J］．Acta Pharmacol Sin，2009，30（1）:78-89．

［3］黃漢飛，曾仲．Kupffer細(xì)胞在肝移植缺血再灌注損傷中的雙重作用［J］．國際外科學(xué)雜志，2009，36（2）:94-97．

［4］宋燕，孫振濤，張弓，等．供肝冷保存再灌注過程中肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及枯否細(xì)胞損傷的比較［J］．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（5）:823-826．

［5］Gu XP，Jiang Y，Xu FT，etal．Effect of cold-ischemia time on nuclear factor-kappaB activation and inflammatory response in graft after orthotopic liver transplantation in rats［J］．World JGastroenterol，2004，10（7）:1000-1004．

［6］Silva MA，Mirza DF，Murphy N，etal．Intrahepatic complement activation，sinusoidal endothelial injury，and lactic acidosis are associated with initial poor function of the liver after transplantation［J］．Transplantation，2008，85（5）:718-725．

［7］Zeng Z，Huang HF，Chen MQ，etal．Heme oxygenase-1 protects donor livers froMischemia/reperfusion injury:the role of Kupffer cells［J］．World JGastroenterol，2010，16（10）:1285-1292．

［8］Sass G，Shembade ND，Haimerl F，etal．TNF pretreatment interferes withmitochondrial apoptosis in themouse liver by A20-mediated down-regulation of Bax［J］．J Immunol，2007，179（10）:7042-7049．

［9］Karidis NP，Kouraklis G，Theocharis SE．Platelet-activating factor in liver injury:a relational scope［J］．World JGastroenterol，2006，12（23）:3695-3706．

［10］Li JQ，Qi HZ，He ZJ，etal．Cytoprotective effects of human interleukin-10 gene transfer against necrosis and apoptosis induced by hepatic cold ischemia/reperfusion injury［J］．J Surg Res，2009，157（1）:e71-e78．

［11］Zhu J，Wang S，Bie P．Apoptosis and regeneration of sinusoidal endothelial cells after extended cold preservation and transplantation of rat liver［J］．Transplantation，2007，84（11）:1483-1491．

［12］Vardanian AJ，Busuttil RW，Kupiec-Weglinski JW．Molecular mediators of liver ischemia and reperfusion injury:a brief review［J］．Mol Med，2008，14（5/6）:337-345．

［13］Linfert D，Chowdhry T，Rabb H．Lymphocytes and ischemia-reperfusion injury［J］．Transplant Rev（Orlando），2009，23（1）:1-10．

［14］Caldwell CC，Tschoep J，Lentsch AB．Lymphocyte function during hepatic ischemia reperfusion injury［J］．J Leukoc Biol，2007，82（3）:457-464．

［15］王斌，叢文銘．肝移植缺血再灌注損傷的臨床病理特點(diǎn)及診斷［J］．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2007，23（4）:480-482．

［16］羅莉，陳引，紀(jì)小龍．肝移植術(shù)供體肝臟及其肝穿活檢臨床病理觀察分析［J］．中華肝膽外科雜志，2009，15（12）:885-887．

［17］Cheng F，Li Y，F(xiàn)eng L，etal．Hepatic stellate cell activation and hepatic fibrosis induced by ischemia/reperfusion injury［J］．Transplant Proc，2008，40（7）:2167-2170．

［18］全國肝膽腫瘤及移植病理協(xié)作組．肝臟移植常見病變的病理診斷與分級(jí)指南（Ⅰ）［J］．中華器官移植雜志，2008，29（1）:49-51．

［19］Arkadopoulos N，Kostopanagiotou G，Theodoraki K，etal．Ischemic preconditioning confers antiapoptotic protection duringmajor hepatectomies performed under combined inflow and outflow exclusion of the liver［J］．World JSurg，2009，33（9）:1909-1915．

［20］Franchello A，Gilbo N，David E，etal．Ischemic preconditioning（IP）of the liver as a safe and protective technique against ischemia/reperfusion injury（IRI）［J］．AMJTransplant，2009，9（7）:1629-1639．

［21］JasseMW，F(xiàn)uggle S，Thompson R，etal．Effect of ischemic preconditioning on the genomic response to reperfusion injury in deceased donor liver transplantation［J］．Liver Transpl，2009，15（12）:1750-1765．

［22］Testa G，Angelova V，Laricchia-Robbio L，etal．Unilateral ischemic preconditioning and heterologous preconditioning in living donor liver transplantation［J］．Clin Transplant，2010，24（3）:334-340．

［23］Carini R，De Cesaris MG，Splendore R，etal．Signal pathway involved in the developmentof hypoxic preconditioning in rathepatocytes［J］．Hepatology，2001，33（1）:131-139．

［24］Lang JD Jr，Teng X，Chumley P，etal．Inhaled NO accelerates restoration of liver function in adults following orthotopic liver transplantation［J］．JClin Invest，2007，117（9）:2583-2591．

［25］Moussavian MR，Scheuer C，SchmidtM，etal．Multidrug donor preconditioning prevents cold liver preservation and reperfusion injury［J］．Langenbecks Arch Surg，2010，396（2）:231-241．

［26］Khan AW，F(xiàn)uller BJ，Shah SR，etal．A prospective randomized trial of N-acetyl cysteine administration during cold preservation of the donor liver for transplantation［J］．Ann Hepatol，2005，4（2）:121-126．

［27］de Rougemont O，Dutkowski P，Clavien PA．Biologicalmodulation of liver ischemia-reperfusion injury［J］．Curr Opin Organ Transplant，2010，15（2）:183-189．