DEP結構域的功能研究進展

王曉江(綜述)，廖之君，林德馨(審校)

(福建醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，福州350004)

結構域是蛋白質結構和功能的基本組成單位。除少量無序化蛋白質外，絕大部分蛋白質是由一個或多個結構域組成的。根據結構分類數據庫定義，結構域可以獨立地復制和折疊。通過研究物種中結構域的分配情況，發現有1235個不同的結構域，由于結構域是物種進化的單元，在不同復雜物種中結構域數目差別很小，大約有34%的結構域被大部分物種共享，這些結構域大部分參與了轉錄、翻譯和新陳代謝的途徑［1］。DEP 結構域(dishevelled，Egl-10 and pleckstrin domain)是一個高度保守的結構域，并且在人類的一些疾病相關蛋白的功能研究中涉及到此結構域，為了進一步探討它的生物學作用，現就DEP結構域的功能進行綜述。

1 DEP結構域的結構組成分析

DEP結構域是一個由接近100個氨基酸組成的蛋白模序。通過序列比對和基因樹重建發現有6個亞家族存在。人類基因組中至少有67種基因編碼該結構域。它有H1、H2、H3三個α螺旋構成其核心結構。在鼠的Epac和人的Pleckstrin的DEP結構域中都含有這種保守的核心區域。其中H1、H2被β發卡結構隔開，H3在兩個β的后面。三個螺旋結構形成了一個疏水性的核心。通過疏水性的作用力來穩定DEP結構域［2］。通過磁共振光譜學分析DEP結構域的功能，其中α螺旋與G蛋白信號調節有關，在Pleckstrin蛋白中的DEP結構域被PH結構域(pleckstrin homologous domain)包圍，通過結構分析和互補性分析發現DEP結構與PH結構域的N端相互作用［3］。

2 DEP結構域的細胞膜錨定功能

DEP結構域能夠通過不同機制與膜結合。許多蛋白中含有DEP高度同源的結構域，比如:Dishevelled(Dvl)、Epac1、Epac2、G 蛋白信號調節蛋白(regulator of G protein signaling，RGS)、Sst2 和哺乳動物中RGS 蛋白 R7 亞家族［4］(RGS6、7、9、11)。其中，Dvl蛋白中的DEP結構域功能研究最早，它包括三個保守的結構域:DIX(Dis/Axin homologous domain)、PDZ(PSD-95 and ZO-1 domain)、DEP，Dvl蛋白是細胞中的一個非常重要的調節蛋白。N末端DIX結構域主要跟經典的Wnt/β-catenin信號通路有關，PDZ與胞質面Wnt蛋白受體Fz的尾部結合，DEP參與Dvl蛋白由胞質到胞膜的錨定。并且和非經典的細胞極性(noncanonical planar cell polarity，PCP)信號通路有關［5］。經典的Wnt/β-catenin信號通路活化需要Dvl蛋白多聚化，連同Fz的共受體低密度脂蛋白受體相關蛋白6一起形成一個超級復合體——Wnt-Fz-低密度脂蛋白受體相關蛋白6-Dvl。通過Fz的C末端結合PDZ結構域親和力比較弱［6］，需要DEP結構域的協助作用。因此，DEP結構域對于形成經典的Wnt/β-catenin信號通路和非經典的PCP通路都發揮重要作用。

2.1 靜電吸引 募集Dvl蛋白的過程最初是依靠一種靜電吸引作用。DEP結構域在保守位點處有賴氨酸和酪氨酸。另外臨近于C末端還有5個酪氨酸，它們被磷酸化后帶正電荷，而胞質內側面帶負電荷，這種細胞內的相互作用對胞內的pH值比較敏感，主要受細胞內Na+/H+交換體Nhe2的影響［7］。當pH值降低時，膜表面的負電荷減少，會使Dvl蛋白的附著困難。同樣的當DEP結構域聚集著大量酸性氨基酸時也會對質膜產生排斥反應。

2.2 假設蛋白模體介導 另一種細胞膜錨定方式是通過假設蛋白模體的介導作用與細胞膜的結合。DEP結構域與假設蛋白模體都能與細胞膜上的網格蛋白配體2蛋白(clathrin adaptor protein 2，AP-2)的亞基μ2有微弱的結合力，并且假設蛋白與富含酪氨酸的DEP結構域結合。AP-2是由 α、β2、σ2、μ2四個亞基組成。DEP結構域通過假設蛋白模體的介導作用，與μ2亞單位的C末端結合［8］。DEP結構域與μ2細長的C末端結合處呈溝槽樣結構，而假設蛋白模體會在與DEP結合后將μ2亞單位表面的溝槽封閉，這樣會使DEP與μ2的結合更加牢固。AP-2配體在開放(有活性)和關閉(無活性)形態中不斷轉化。Wnt信號通過Fz和Dvl蛋白激活磷脂酰肌醇4激酶和磷脂酰肌醇5激酶的活性，產生大量磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，通過 α、β2、μ2 亞基使磷脂酰肌醇4，5-二磷酸富集在膜上，并通過磷脂酰肌醇4，5-二磷酸磷酸化μ2連接區域，使其處于活化狀態。假設蛋白模體只能在AP-2配體開放狀態下結合，而在關閉狀態下，DEP結構域雖然具有較低的親和力，但然可以維持與AP-2的結合［9］。在Wnt信號通路激活的情況下，通過網格蛋白介導對Fz和Dvl蛋白的內吞，激活PCP信號通路。在開放狀態下，該復合體的結合更加牢固，因而能夠確保內吞作用的發生［10］。

3 DEP結構域的信號轉導功能

3.1 Dvl蛋白 Dvl蛋白中DEP結構域的C末端可以與G蛋白的βγ亞單位結合，隨后會激活磷脂酶C、Ca2+和蛋白激酶C信號途徑，破壞Dvl蛋白的空間結構，最終導致 Dvl蛋白降解，關閉 Wnt信號通路［11］。

3.2 T細胞因子4 T細胞因子4(T cell factor 4，TCF4)/β-catenin 復合體是典型的 Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵分子，Wong等［12］報道Dvl-DEP結構域能夠阻止Wnt蛋白誘導的TCF4基因的表達。通過磁共振結構分析發現，DEP的C末端還可以抑制TCF4基因的活性，并激活 JNK信號通路［13］。鼠蓬亂蛋白DEP結構域相互作用蛋白也稱為Spats1，是一種新的蛋白，能夠與Dvl-DEP蛋白相互作用，調節Wnt信號［14］。有證據表明，鼠蓬亂蛋白DEP結構域相互作用蛋白能夠抑制被Wnt1、Dvl2或β-catenin蛋白所激活的Lef-1熒光報告的強度，通過蛋白酶體復合物途徑，促進TCF4的降解，阻斷TCF4與β-catenin的結合。以上結果顯示，DEP結構域在Wnt信號通路中同時介導負性調節。

3.3 RGS 7家族蛋白 RGS 7家族蛋白包括DEP、GGL和DHEX三個結構域，與Gβ亞單位相互作用形成Gβ5-RGS7復合體［15］，阻止 Ca2+內流引起的毒蕈堿三類受體活化。毒蕈堿三類受體第一和第二個環都非常短而且高度保守，第三個環很長，而且具有多樣性。DEP結構域可以直接結合到毒蕈堿三類的第三個環上，位于第345～390個氨基酸位點。單獨的DEP結構域能夠抑制毒蕈堿三類受體活化，并且刪除DEP結構域后，Gβ5-RGS7復合體失去對毒蕈堿三類的抑制作用［16］。

4 DEP結構域調節小分子GTP酶和下游因子的功能

4.1 G蛋白 DEP結構域出現在大量的信號分子中(包括RGS)，它能夠與膜上突出的可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性的融合蛋白附著蛋白受體家族蛋白結合，使蛋白定位于膜上發揮活性作用。RGS蛋白通過DEP結構域介導與G蛋白受體蛋白C末端結合，使RGS蛋白停靠于接近G蛋白亞單位的位置［17］。通過調節G蛋白亞單位尿苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase，GTP)的活性調節信號轉導。

4.2 Epac1 Epac1是環腺苷酸依賴性的鳥嘌呤交換因子，具有1個或2個環腺苷酸結合位點、一個DEP結構域和GEF催化位點。通過與環腺苷酸結合和分離誘導Epac1發生活化與失活的轉變。當DEP結構域發生缺失突變，會使Epac1完全喪失膜定位功能。如果Epac1中DEP結構域第82位精氨酸突變，也會使環腺苷酸誘導的Epac1活性功能喪失［18］。進一步說明了DEP結構域在Epac1活化過程中發揮著重要作用。

4.3 LRRK2與 Dvl1～3 LRRK2與 Dvl1～3對于軸突和突觸的建立非常重要。編碼富亮氨酸重復激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)基因發生突變會導致帕金森病。LRRK2復雜Ras蛋白復合體-復雜Ras蛋白復合體C末端結構域能抑制GTP酶的活性，控制 LRRK2激酶的活性。而 Dvls與LRRK2Ras復雜蛋白C末端結構域的結構相似，也能夠與小 GTP酶結合并調節 GTP酶的活性［19］。LRRK2與Dvl共表達能夠增加LRRK2穩定期蛋白水平，這種作用依賴于DEP結構域的功能。

5 DEP結構域促進細胞極性確立的功能

DEP結構域在PCP信號通路中是必需的。PCP信號通路是一條非經典Wnt信號通路。近年來相關研究表明［20］，可以調控細胞極性排列，完成細胞形態發生(如上皮細胞)的細胞極性的確立以及在胚胎形成過程中參與原腸胚/神經胚期會聚延伸運動，參與調控神經管閉合過程。通過構建包含DEP的結構域(但不含催化位點的小分蛋白)來研究DEP結構域的功能，發現單獨的DEP結構域有利于紡錘體極性的確定，甚至優于Dvl蛋白本身。提示DEP結構域能夠促使紡錘體正確形成，Dvl蛋白通過細胞內或細胞間的信號限制了DEP結構域的作用［21］。

6 展望

結構域是蛋白結構和功能的基本單位決定著蛋白質的功能。DEP結構域的功能與細胞膜的錨定、信號轉導、小分子GTP酶活性的調節以及細胞極性的確立等密切相關。并且從生物大分子的結構分析，取得了對細胞功能活動更深入的認識。但是，目前對DEP結構域還存在一些問題沒有解答。從基因組學及蛋白質組學上進一步研究將會有重大意義。①從“定性”及“定量”角度分析。由于基因表達的時空特異性，DEP結構域表達是否會選擇性的在某些組織中表達，或者在不同的組織中表達的量存在差異。通過對結構域進行全面的分析，有助于全面認識組織特異性的蛋白質特征及其結構基礎。②根據DEP結構域特點構建新型融合蛋白。有望發現具有重大功能的蛋白質或結構域。從結構域結構、功能等方面著手研究，為解釋生物個體發生、發展機理提供了新的視野。

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