促凋亡基因puma的研究進展

宋 宇(綜述)，段 勇，王玉明(審校)

(昆明醫學院第一附屬醫院檢驗科，昆明650032)

細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主有序的死亡，在生物體的進化、內環境的穩定以及多個系統的發育中起著重要作用。凋亡抑制會導致自身免疫性疾病或腫瘤，而凋亡亢進與組織器官退行性病變有關。凋亡是多基因嚴格控制的過程，涉及一系列凋亡信號轉導系統，目前比較清楚的通路主要有外源性途徑和內源性途徑。Bcl-2家族分子在內源性(線粒體)途徑中起重要作用，其中p53上調凋亡調控因子(puma)是Bcl-2家族BH3-only亞家族成員，可被p53快速誘導并具有強大的促凋亡作用。

1 puma的結構和功能

2001 年，Yu［1］和 Nakano 等［2］兩個獨立的研究小組分別從結直腸癌細胞系和人類成骨細胞樣細胞中分離出新的可被p53快速誘導并具有強大促凋亡作用的p53靶基因，后被鑒定為同一基因，并命名為puma。人 puma 基因定位于 19q13.3～ q13.4，cDNA全長1.9 kb，富含GC序列。該基因具有4個外顯子(1a或1b、2、3、4)和3 個內含子，其中外顯子 2 含假定的轉錄起始位點，外顯子3中含編碼BH3的序列。轉錄后形成四種不同的剪接體(puma-α、-β、-γ 和-δ)。其中只有 puma-α(相對分子質量為 23×103)和puma-β(相對分子質量為18×103)編碼的蛋白中含有促凋亡活性所必需的BH3功能結構域。puma編碼產物為193個氨基酸的蛋白質，其中C端疏水序列和BH3結構域分別是puma定位和促凋亡功能的基礎。puma直接或間接地與抗凋亡Bcl-2蛋白發生相互作用，解除Bcl-2/Bcl-xL對Bax/Bak的抑制作用，Bax/Bak構象改變后在線粒體膜上形成寡聚物，使膜通透性增加、外膜電勢降低、釋放細胞色素C入胞質，啟動caspase級聯反應，最終發生細胞凋亡。

2 puma在細胞凋亡中的作用

迄今為止一共發現了8個BH3-only蛋白，它們在哺乳動物中廣泛存在，有學者提出特異性應激刺激能協同個別BH3-only蛋白激活線粒體凋亡途徑的假說，puma作為BH3-only家族成員也得到了廣泛研究［3］。生理狀況下puma表達量較低，但在DNA損傷藥物、血清饑餓和內質網應激等刺激誘導下可顯著升高。研究表明［3］，puma-/-細胞株對p53轉錄依賴的刺激(如γ射線)和p53轉錄非依賴的刺激(如細胞因子缺失、糖皮質激素和佛波酯等)發生凋亡抵抗現象。近年來，puma在促凋亡過程中的作用得到了廣泛認可，研究puma在凋亡相關疾病和細胞株中的表達、在化學物質暴露下的表達改變成為了當前研究的熱點。

2.1 puma在細胞株中的表達 Uo等［4］發現在原代培養的鼠神經細胞中，puma基因的表達與喜樹堿誘導的神經細胞凋亡密切相關。Niizuma等［5］通過夾閉大鼠雙側頸總動脈構建短暫性腦缺血模型，發現海馬CA1區線粒體樣本的puma蛋白表達顯著上調，免疫共沉淀顯示puma與Bax結合，表明puma在短暫性腦缺血后海馬CA1區遲發性神經元死亡中發揮著重要作用。Kuroki等［6］采用線栓法制備鼠短暫性腦缺血/再灌注動物模型，在不同的時間點取出腦組織進行mRNA定量分析和蛋白質印跡分析，結果顯示栓塞側皮質puma mRNA和PUMA蛋白明顯高于對側，該實驗為局灶性腦缺血引起BH3-only基因puma的轉錄和翻譯提供了體內實驗依據。Ghosh等［7］分別對出生 7 d 的 puma-/-、Noxa-/-、Bim-/-、Hrk-/-和p53-/-幼鼠皮下注射乙醇以模擬宮內乙醇暴露的影響。結果顯示，僅puma-/-幼鼠神經細胞明顯抵抗凋亡，表明宮內乙醇暴露通過p53非依賴、Bax和puma依賴的途徑誘導神經細胞凋亡。

人肝臟Huh-7細胞株在飽和脂肪酸刺激下發生脂性凋亡，puma mRNA和蛋白表達顯著上調，RNAi干擾 puma后細胞凋亡被明顯抑制［8］。McKenzie等［9］將 Bim-/-、Noxa-/-、puma-/-、Bid-/-的胰島 β細胞分別暴露于高濃度葡萄糖，發現puma-/-明顯抵抗線粒體途徑凋亡，表明puma在葡萄糖毒性誘導的胰島β細胞凋亡中起了關鍵作用。

Waster等［10］利用紫外燈管模擬紫外光源照射人黑素瘤細胞后發現，紫外輻射導致黑素瘤細胞凋亡，puma mRNA表達量隨紫外光源照射暴露的時間呈時間依賴性。Karst等［11］研究了107例原發性黑素瘤、51例轉移性黑素瘤和64例結構不良痣后發現，puma表達與惡性程度呈顯著負相關，是5年疾病特異生存率的獨立預測因子。

免疫細胞大量凋亡是導致膿毒癥高病死率的重要因素之一。抑制免疫細胞的凋亡成為了控制膿毒癥進展的靶點。Brahmamdam等［12］構建小鼠盲腸結扎穿孔膿毒癥模型，發現敗血癥脾臟CD4+T細胞中puma表達與對照組差異有統計學意義。siRNA沉默puma基因后，CD4+T細胞中PUMA蛋白顯著下降，同時免疫細胞存活率上升，表明puma在凋亡引起的CD4+T免疫細胞耗竭中起著重要作用。Inoue等［13］的研究也表明白細胞介素15通過增加抗凋亡Bcl-2、減少促凋亡基因Bim和PUMA蛋白表達來抑制免疫細胞凋亡。

Obexer等［14］利用 RNAi干擾 puma后發現，糖皮質激素誘導的p16INK4A重組白血病細胞的凋亡被顯著抑制，表明puma表達在很大程度上介導抑癌基因p16INK4A誘導的凋亡敏感性。Iglesias-Serret等［15］發現puma在阿司匹林誘導的人白血病細胞株凋亡中發揮促凋亡作用。

Hoque等［16］對30例原發腫瘤標本和10株頭頸部鱗癌細胞株的puma編碼區序列進行檢測，結果表明無論p53處于何種突變狀態，所有標本中均未見puma突變。徐波等［17］發現，糖皮質激素在誘導體外培養的白血病細胞凋亡過程中，不能引起puma表達的上調。

2.2 puma在人體組織中的表達 陳鑫等［18］利用半定量反轉錄-聚合酶鏈反應檢測胃癌組織、癌旁組織中四種剪接體的mRNA表達水平，發現puma四種剪接體在胃癌組織中的表達下調，與癌的發生呈負相關。Jansson等［19］應用免疫組化和半定量反轉錄聚合酶鏈反應技術研究散發的大腸癌，發現puma mRNA、蛋白在腫瘤組織中的表達與正常黏膜相比，既有上調也有下調，puma上調或下調與臨床病理特征及預后均無相關性，因此得出puma表達的改變在大腸癌的發展中發揮次要的作用。王玉明等［20］研究表明，puma mRNA和蛋白在非小細胞肺癌、癌旁和遠癌肺組織和肺良性病變組織中差異無統計學意義，puma表達可能不是伴隨肺癌發生和侵襲發展過程的重要因素。puma在某些細胞株凋亡、腫瘤組織和自身免疫疾病等的發生、發展中發揮著重要作用，但在某些組織或細胞中可能發揮次要作用或不發揮作用。

3 化學藥物對puma表達的影響

皮質神經細胞經河豚毒素處理3 d后，puma基因表達水平顯著升高并最終導致細胞凋亡［21］。Zn2+使神經母細胞瘤細胞株中的puma表達呈劑量和時間依賴效應［22］。植物赫曲毒素A能上調人肝癌細胞puma表達［23］。組蛋白去乙酰酶抑制劑通過p53-puma-Bax途徑誘導神經母細胞瘤細胞的凋亡［24］。抗腫瘤藥物Zolinza/vorinostat能顯著提高耐藥乳腺癌細胞移植的裸鼠對腫瘤壞死相關凋亡誘導配體誘導的凋亡敏感性［25］。Hung 等［26］發現，puma 在一氧化氮誘導的神經前體細胞線粒體凋亡過程中發揮著關鍵作用。

4 其他轉錄途徑調節和轉錄后調節puma

Lam 等［27］發現，MAP4K3 通過 mTORC1(哺乳動物雷帕霉素靶)轉錄后調節PUMA蛋白表達，進一步激活Bax，最終促進胰腺癌細胞株的凋亡。Sun等［28］發現，puma通過p73β和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號途徑介導上皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑誘導的頭頸部鱗狀細胞癌細胞株凋亡，為了進一步驗證puma在該途徑中的作用，Sun等［28］應用短發夾RNA干擾puma后發現，鱗狀細胞癌細胞株凋亡率顯著降低。絲/蘇氨酸蛋白激酶通過磷酸化降低TAp63蛋白的穩定性來抑制TAp63誘導的肝腫瘤細胞凋亡［29］，在p53變異的肝腫瘤細胞株中剔除絲/蘇氨酸蛋白激酶能反式激活puma，并進一步誘導細胞凋亡。除此之外，細胞轉錄因子、缺氧誘導因子1α和FoxO3a也轉錄調節puma基因［30-32］。

5 問題與展望

自2001年幾個實驗室相繼報道了puma基因強大的促凋亡作用之后，對puma的研究逐漸成為熱點，不少研究已經證實了puma在介導多種腫瘤細胞株凋亡中的重要作用，但仍有許多問題亟待解決:①puma缺陷是否會有發生腫瘤的傾向。②體外實驗表明誘導puma表達能促進腫瘤細胞凋亡，但在體內試驗中的效果和安全性不能確定。③某些情況下p53和puma過表達細胞卻不發生凋亡的原因尚待探究。④puma還受到哪些因素和途徑調控，以及這些調控網絡之間的聯系也待闡明。目前研究puma在組織和細胞株中的促凋亡作用以及化學藥物對puma的影響都是為今后的體內實驗和腫瘤治療作準備。相信隨著研究的逐漸深入，對惡性腫瘤和凋亡相關疾病的治療會有突破性進展。

［1］Yu J，Zhang L，Hwang PM，et al.puma induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells［J］.J Mol Cell，2001，7(3):673-682.

［2］Nakano K，Vousden KH.puma，a novel proapoptotic gene，is induced by p53［J］.J Mol Cell，2001，7(3):683-694.

［3］Ward MW，K?gel D，Prehn JH.Neuronal apoptosis:BH3-only proteins the real killers?［J］.J Bioenerg Biomembr，2004，4(36):295-298.

［4］Uo T，Kinoshita Y，Morrison RS.Apoptotic actions of p53 require transcriptional activation of puma and do not involve a direct mitochondrial/cytoplasmic site of action in postnatal cortical neurons［J］.J Neurosci，2007，27(45):12198-12210.

［5］Niizuma K，Endo H，Nito C，et al.Potential role of puma in delayed death of hippocampal CA1 neurons after transient global cerebral ischemia［J］.Stroke，2009，40(2):618-625.

［6］Kuroki K，Virard I，Concannon CG，et al.Effects of transient focal cerebral ischemia in mice deficient in puma［J］.Neurosci Lett，2009，451(3):237-240.

［7］Ghosh AP，Walls KC，Klocke BJ，et al.The proapoptotic BH3-only，Bcl-2 family member，puma is critical for acute ethanol-induced neuronal apoptosis［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2009，68(7):747-756.

［8］Cazanave SC，Mott JL，Elmi NA，et al.JNK1-dependent puma expression contributes to hepatocyte lipoapoptosis［J］.J Biol Chem，2009，284(39):26591-26602.

［9］McKenzie MD，Jamieson E，Jansen ES，et al.Glucose induces pancreatic islet cell apoptosis that requires the BH3-only proteins Bim and PUMA and multi-BH domain protein Bax［J］.Diabetes，2010，59(3):644-652.

［10］Waster PK，Ollinger KM.Redox-dependent translocation of p53 to mitochondria or nucleus in human melanocytes after UVA-and UVB-induced apoptosis［J］.J Invest Dermatol，2009，129(7):1769-1781.

［11］Karst AM，Dai DL，Martinka M，et al.puma expression is significantly reduced in human cutaneous melanomas［J］.Oncogene，2005，24(6):1111-1116.

［12］Brahmamdam P，Watanabe E，Unsinger J，et al.Targeted delivery of siRNA to cell death proteins in sepsis［J］.Shock，2009，32(2):131-139.

［13］Inoue S，Unsinger J，Davis CG，et al.IL-15 prevents apoptosis，reverse innate and adaptive immune dysfunction，and improves survival in sepsis［J］.J Immunol，2010，184(3):1401-1409.

［14］Obexer P，Hagenbuchner J，Rupp M，et al.p16INK4A Sensitizes human leukemia cells to FAS-and glucocorticoid-induced apoptosis via induction of BBC3/puma and repression of Mcl-1 and Bcl-2［J］.J Biol Chem，2009，284(45):30933-30940.

［15］Iglesias-Serret D，Piqué M，Barragán M，et al.Aspirin induces apoptosis in human leukemia cells independently of NF-kappaB and MAPKs through alteration of the Mcl-1/Noxa balance［J］.Apoptosis，2010，15(2):219-229.

［16］Hoque MO，Begum S，Sommer M，et al.PUMA in head and neck cancer［J］.Cancer Lett，2003，199(1):75-81.

［17］徐波，王保捷，李愛敏，等.糖皮質激素對急性淋巴細胞白血病puma表達的影響［J］.中國當代兒科雜志，2006，8(2):151-154.

［18］陳鑫，張尤歷，烏慧玲，等.puma基因在胃癌組織及細胞中的表達［J］.世界華人消化雜志，2010，18(12):1227-1231.

［19］Jansson A，Arbman G，Sun XF，et al.mRNA and protein expression of puma in sporadic colorectal cancer［J］.Oncol Rep，2004，12(6):1245-1249.

［20］王玉明，金克煒，李婭，等.非小細胞肺癌中puma基因外顯子突變和mRNA表達的分析［J］.中華病理學雜志，2009，38(2):121-122.

［21］Schonfeld-Dado E，Fishbein I，Segal M.Degeneration of cultured cortical neurons following prolonged inactivation:molecular mechanisms［J］.J Neurochem，2009，110(4):1203-1213.

［22］Hara H，Kamiya T，Adachi T，et al.Zinc induces expression of the BH3-only protein PUMA through p53 and ERK pathways in SHSY5Y neuroblastoma cells［J］.Neurochem Res，2009，34(8):1498-1506.

［23］El Golli Bennour E，Rodriguez-Enfedaque A，Bouaziz C，et al.Toxicities induced in cultured human hepatocarcinoma cells exposed to ochratoxin A:oxidative stress and apoptosis status［J］.J Biochem Mol Toxicol，2009，23(2):87-96.

［24］Uo T，Veenstra TD，Morrison RS.Histone deacetylase inhibitors prevent p53-dependent and p53-independent Bax-mediated neuronal apoptosis through two distinct mechanisms［J］.J Neurosci，2009，29(9):2824-2832.

［25］Shankar S，Davis R，Singh KP，et al.Suberoylanilide hydroxamic acid(Zolinza/vorinostat)sensitizes TRAIL-resistant breast cancer cells orthotopically implanted in BALB/c nude mice［J］.Mol Cancer Ther，2009，8(6):1596-1605.

［26］Hung AC，Porter AG.p53 mediates nitric oxide-induced apoptosis in murine neural progenitor cells［J］.Neurosci Lett，2009，467(3):241-246.

［27］Lam D，Dickens D，Reid EB，et al.MAP4K3 modulates cell death via the post-transcriptional regulation of BH3-only proteins［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(29):11978-11983.

［28］Sun Q，Ming L，Thomas SM，et al.puma mediates EGFR tyrosine kinase inhibitor-induced apoptosis in head and neck cancer cells［J］.Oncogene，2009，28(24):2348-2357.

［29］Komatsu S，Takenobu H，Ozaki T，et al.Plk1 regulates liver tumor cell death by phosphorylation of TAp63［J］.Oncogene，2009，28(41):3631-3641.

［30］Hershko T，Ginsberg D.Up-regulation of Bcl-2 homology 3(BH3)-only proteins by E2F1 mediates apoptosis［J］.J Biol Chem，2004，279(10):8627-8634.

［31］Lee MJ，Kim JY，Suk K，et al.Identification of the hypoxia-inducible factor 1 alpha-responsive HGTD-P gene as a mediator in the mitochondrial apoptotic pathway［J］.Mol Cell Biol，2004，24(9):3918-3927.

［32］You H，Pellegrini M，Tsuchihara K，et al.FoxO3a-dependent regulation of puma in response to cytokine/growth factor withdrawal［J］.J Exp Med，2006，203(7):1657-1663.