miRNA與腫瘤耐藥關系的研究進展

馬維娜(綜述)，王世明，原永芳(審校)

(上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院藥劑科，上海201900)

miRNA是一類廣泛存在于生物體內、長度在19～25 bp之間、高度保守的非編碼小RNA，通過堿基配對與相應的靶mRNA的3'非編碼區結合，導致靶mRNA降解或轉錄后翻譯抑制。目前，人類基因組中確認的miRNA約500個，至少有200多種與癌癥的發生有關，許多miRNA可能扮演著癌基因和抑癌基因的角色［1］。腫瘤細胞對化療藥物產生抗藥性，是導致化學治療失敗的主要原因之一，腫瘤細胞的耐藥性包括原發性耐藥和獲得性耐藥。近年來，許多實驗室證實miRNA的表達水平與腫瘤細胞耐藥性的產生有著密切的關系，現就miRNA與腫瘤的發生、發展及與腫瘤耐藥的關系予以綜述。

1 miRNA與腫瘤

miRNA在生物學中起著重要的作用，包括細胞增殖、分化、凋亡、應激耐受及生理新陳代謝。實驗及臨床研究表明，miRNA與腫瘤的發生和發展進程密切相關，miRNA的異常表達與腫瘤的分期、進展及代謝有關［2］。一些 miRNA 在腫瘤細胞中表達降低，提示它們可能作為抑癌基因，這些miRNA 包 括 let-7、miR-15、miR-16、miR-17-5p、miR-29、miR-34、miR-124a、miR-127、miR-143、miR-145、miR-181等。在這些基因中，let-7家族研究較多，let-7發生突變的細胞不能進入正常的細胞周期，不能在正確的時間進行分化，肺癌組織中let-7表達水平降低，且低表達let-7的患者生存期縮短，這提示let-7可能是一個腫瘤抑制基因，并且可以作為腫瘤監測和腫瘤預后的生物學標志物［3］。miR-15和 miR-16定位于人染色體13q14的LEU2區域內，在人類慢性淋巴細胞白血病中充當著抑癌基因的角色，是最早得到證實的與腫瘤有相關性的miRNA。后來有研究結果顯示，抗凋亡蛋白Bcl-2是miR-15a和miR-16-1的靶基因之一，miR-15a和miR-16-l可以從轉錄后水平負性調控Bcl-2表達。此研究結果提示，miR-15a和miR-16-1可以被用來治療過度表達Bcl-2的腫瘤。miR-34是另一種具有腫瘤抑制作用的重要miRNA，定位于人類染色體1p36，是一個在人類腫瘤(如神經母細胞瘤)中常發生缺失的區帶［4］。miR-34家族成員(miR-34a和miR-34b/c)是抑癌基因p53的直接靶分子;而p53是人類最常見癌癥的突變基因之一，可以激活一系列的轉錄產物，誘導細胞周期阻滯、凋亡及衰老。在多種癌細胞培養體系的體外研究中(如乳腺癌、非小細胞肺癌等)，無論是外源性還是生理性的應激均可通過p53途徑引起miR-34的高表達。

其他的一些miRNA在腫瘤細胞中表達增加，提示它們具有致癌活性。已知的致癌活性miRNA包括miR-21、miR-155、miR-221、miR-222 和 miR-17-92 等。miR-21被認為是經典的癌基因miRNA，位于染色體17q23．2上的空泡膜蛋白基因的3'非編碼區，該區域經常在神經細胞瘤、乳腺癌、結腸癌和肺癌中表達增強。包括 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1在內的miR-17-92基因簇在多種腫瘤細胞中也顯示了致癌活性［5，6］。動物實驗表明，加強miR-17-92基因簇和原癌基因的表達可以加快鼠B細胞淋巴瘤模型中腫瘤的生長［7］。miR-155在多種腫瘤細胞中高水平表達，其在胰腺癌中的高表達與患者的低生存率密切相關。腫瘤組織中miR-155高表達患者比miR-155低表達患者的腫瘤相關性死亡風險高 6．2 倍［6，8］。miR-372 和 miR-373 可能是睪丸生殖細胞癌的癌基因，現已證明miR-372和miR-373通過抑制p53介導的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制途徑或者直接抑制抑癌基因LATS2的表達，促進增殖，從而促使睪丸胚胎細胞腫瘤的形成［9］。

2 miRNA在腫瘤耐藥中的作用

化療是腫瘤治療的一個重要措施，但是，由于抗腫瘤藥物存在耐藥性，因此化療不能完全消除腫瘤細胞，這也是腫瘤再生的一個重要原因。近幾年研究表明，miRNA通過調控靶基因表達，影響細胞凋亡、增殖和分化，不僅與腫瘤轉移有關，而且與腫瘤耐藥關系密切。miRNA的突變、異常表達和異常加工均會影響miRNA的正常功能，導致靶基因的蛋白表達水平異常。研究耐藥腫瘤細胞中miRNA的差異表達以及與耐藥相關基因之間的調控關系，對闡明耐藥機制具有重要意義。

2．1 miR-221和miR-222在抗雌性激素及腫瘤壞死因子相關誘導配體中的耐藥性 miR-221和miR-222是致癌的miRNA且容易使腫瘤細胞產生耐藥性。比較對抗雌激素藥物氟維司群耐藥的MCF-7-FR細胞和對該藥物敏感的MCF-7親代細胞中miRNA、mRNA的表達，發現兩種miRNA(miR-221和miR-222)表達上調，14 種 miRNA(包括 let-7i、miR-181a、miR-638、miR-204、miR-191、miR-346、miR-212、miR-328、miR-211、miR-424)下調，說明了 miR-221和 miR-222對抗雌激素的藥物耐藥［10］。研究表明，在對他莫昔芬耐藥的MCF-7細胞中，miR-221、miR-222和miR-181表達上調而miR-21、miR-342和miR-489表達下調，并發現miR-221、miR-222能直接負調控細胞周期抑制蛋白p27和ERa的表達，增強乳腺癌細胞對他莫西芬及其他化療藥物的耐藥性。miR-221或miR-222的異常表達可通過抑制靶點p27Kip1使MCF-7親本細胞對他莫西芬耐藥，而在耐藥細胞中這種靶點可減少50%。此外，腫瘤壞死因子相關誘導配體參與腫瘤壞死因子誘導的細胞凋亡，研究篩選出對腫瘤壞死因子相關誘導配體敏感性不同的4個非小細胞肺癌細胞系，通過比較它們在miRNA表達譜上的區別，最終證實高表達的miR-221和miR-222通過下調P27kip1抑制了腫瘤壞死因子相關誘導配體介導的細胞凋亡信號通路［11］。

2．2 miRNA let-7家族及耐藥性 以往研究證實，miRNA中的“明星分子”let-7家族屬于抑癌基因，可直接下調原癌基因Ras及HMGA2的表達，并抑制細胞增殖，在腫瘤細胞中存在低表達現象。但Tsang等［12］的研究表明，let-7a通過下調細胞凋亡中的啟動酶CASP3抑制了細胞凋亡，在A431和HepG2細胞中過表達，let-7a可增強它們對阿霉素、紫杉醇及干擾素γ的耐藥性，抑制let-7a則增加化療藥物引發的細胞凋亡。Yu等［13］通過對卵巢癌標準化療方案耐藥患者的miRNA芯片研究發現，let-7i在耐藥患者中表達明顯減少，并在細胞水平進一步證實了let-7i下調與順鉑耐藥有關，提示調控Let-7i的表達有可能克服卵巢癌的耐藥性。

2．3 miR-200c與腫瘤耐藥 miR-200c屬于miR-200家族，有研究顯示，miR-200c及其調控通路中的一些因子與腫瘤耐藥有關，能通過調控不同的靶點增加細胞對紫杉醇和表皮生長因子抑制劑的藥物敏感度。miR-200c在低分化的子宮內膜、乳腺巢癌細胞中呈低表達，若恢復miR-200c在卵巢癌細胞中的表達能夠明顯增強其對紫杉醇等靶向作用于細胞微管化療藥物介導的凋亡，并發現miR-200c是通過抑制耐藥因子TUBB3的表達起調控作用［14］。最新研究通過實時熒光定量(RFQ-PCR)分析發現，對順鉑耐藥的胃癌SGC7901/DDP細胞株中miR-200c的表達比對順鉑敏感的SGC7901細胞株顯著降低。為進一步觀察miR-200c在腫瘤細胞中對順鉑耐藥的可能作用，將miR-200c前體片段轉染胃癌SGC7901/DDP細胞，通過RFQ-PCR分析發現，轉染后細胞中miR-200c的表達顯著增加，其對順鉑敏感度也出現了顯著的改變，miR-200c能夠增加SGC7901/DDP細胞對順鉑的敏感度，因此可以認為miR-200c在逆轉胃癌細胞對順鉑耐藥過程中發揮著一定的作用［15］。

2．4 miR-27與腫瘤耐藥 另有報道miR-27a在多藥耐藥基因高表達的腫瘤細胞中表達異常，與耐藥關系密切［16］。最近研究采用實時PCR技術檢測卵巢癌A2780細胞及其紫杉醇耐藥細胞A2780/Taxol中miR-27a的表達水平。利用脂質體lipofectamine 2000將成熟miR-27a的模擬物、阻遏物及陰性對照轉染A2780和A2780/Taxol細胞，實時PCR技術檢測轉染細胞中MDRl基因mRNA的表達;蛋白印跡法檢測轉染細胞中P-gp和同源結構域相關的蛋白激酶2蛋白的表達。結果顯示，miR-27a在卵巢癌A2780/Taxol細胞中高表達;轉染miR-27a阻遏物后A2780/Taxol細胞中MDRl基因和P-gp蛋白的表達均下降，對紫杉醇的敏感性增加，提示可以通過下調P-gp的表達和功能，增加A2780/Taxol細胞對紫杉醇的敏感性，部分逆轉耐藥;將miR-27a模擬物轉染A2780細胞后，MDRI mRNA表達水平明顯升高。表明miR-27a可能通過直接作用于某些下游靶基因，而間接調控MDR1及P-gp的表達和功能［17］。

3 以miRNA為靶點增加藥物敏感性

最近的研究表明，大豆異黃酮、3，3'-二吲哚甲烷、吲哚-3-甲醇、姜黃素、兒茶素酸酯等天然提取物可以改變特定miRNA的表達［18-22］。考慮到這些天然提取物的相對無毒性特征，以miRNA為靶點，應用這些天然提取物并結合傳統的化療方法，可能是一種新的安全并且療效更好的治療方案。Sun等［21］報道了防治腫瘤的天然提取物——姜黃素，能夠改變胰腺腫瘤細胞中的miRNA表達譜，他們發現可以用姜黃素上調miR-22的表達或者用pre-miR-22s轉染來抑制其靶基因SP1的轉錄因子和雌激素受體1的表達。另一種天然提取物:吲哚-3-甲醇，能夠上調miR-21 的靶基因 PTEN、PDCD4 和 RECK［20］，因此通過吲哚-3-甲醇上調miR-21靶基因的表達可能是提高藥物敏感性的一種新策略。Tsang等［22］最近報道了兒茶素酸酯在人腫瘤細胞miRNA表達中的作用，發現兒茶素酸酯能夠上調miR-16且下調Bcl-2的表達。因為miR-16具有增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性這一作用，兒茶素酸酯可能是通過上調miR-16的表達增加了藥物的敏感性。Li等［19］研究了大豆異黃酮和3，3'-二吲哚甲烷對胰腺癌細胞中miRNA的作用，這些細胞對吉西他濱耐藥，發現通過pre-miR-200轉染使得miR-200再表達，或者應用異黃酮或3，3'-二吲哚甲烷治療對吉西他濱耐藥的腫瘤，能引起miR-200的上調以及 ZEB1、slug、波形蛋白的下調，同樣，異黃酮和3，3-二吲哚基甲烷也能誘發let-7的表達，用吉西他濱治療miR-200b轉染的腫瘤耐藥細胞可使腫瘤生長抑制率達到20．8%～38．2%。腫瘤耐藥細胞經3，3'-二吲哚甲烷預處理后生長抑制率提高14．8%～17．4%，通過異黃酮預處理后生長抑制率提高 15．4%～17．1%［19］。因此，傳統的化療方案結合異黃酮或3，3'-二吲哚甲烷治療是治療胰腺癌一個新的較好的方案。

4 小結與展望

miRNA在腫瘤的發生、發展及腫瘤的耐藥和預后中發揮著重要作用。但對miRNA的了解還非常有限，開發基于miRNA的診療手段還需要更多、更詳盡的研究。近年來的研究證實了miRNA在抗腫瘤藥物的敏感性和耐藥性中起了重要的作用，miRNA的異常表達能降低抗腫瘤藥物，如吉西他濱、多西他賽、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、他莫昔芬等對腫瘤細胞的反應。因此，以特定的miRNA為治療靶點，通過比較miRNA表達譜，與腫瘤細胞耐藥性密切相關的特定miRNA將被識別，這可能為新的靶向治療方案開辟途徑，從而改善治療效果。某些天然產物，如異黃酮、3，3'-二吲哚甲烷、吲哚-3-甲醇、姜黃素、兒茶素酸酯或其他尚未開發的天然提取物等也許會成為以miRNA為靶點的新的治療藥物。值得注意的是，除了能改變藥物敏感性的特定miRNA，一些研究表明其他的非編碼RNA、穹隆體RNA，也能調節抗腫瘤藥物的耐藥性［23］。人穹隆體RNA產生的一些小RNA(svRNA)與miRNA相似，也能調節基因表達。已經發現svRNAb能下調CYP3A4的表達，CYP3A4是藥物代謝中的關鍵酶，能改變腫瘤細胞的耐藥性［23］，這提示這種新發現的小分子與miRNA相似，或許與部分的體內耐藥有關聯。因此認為，尚有許多抗癌藥物耐藥的調控機制有待發現，以這些小RNA為靶點開發新的治療方案正被提上日程，相信會有很好的發展前景。

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