甲磺酸伊馬替尼的耐藥機制及逆轉策略

吳榮娟(綜述)，馬旭東(審校)

(福建醫科大學附屬漳州市醫院血液科，福建漳州363000)

慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種發生在早期多能造血干細胞上的惡性骨髓增殖性疾病。95%以上的CML細胞中有特征性t(9;22)(q34;q11)，形成bcr/abl融合基因，其編碼的p210bcr/abl蛋白具有高酪氨酸激酶的活性，可導致自身酪氨酸殘基磷酸化及許多重要的底物蛋白磷酸化，使細胞惡性轉化，過度增殖和凋亡受阻。甲磺酸伊馬替尼是2-苯氨嘧啶的衍生物，是作用于bcr/abl酪氨酸激酶的抑制劑，它能競爭性抑制ATP或底物與酪氨酸激酶催化中心結合，阻止酪氨酸激酶活化從而發揮靶向治療作用。

1 伊馬替尼的耐藥機制

隨著伊馬替尼治療時間的延長，原發或繼發耐藥導致的治療失敗越來越多見，已嚴重制約了其臨床應用。目前對于伊馬替尼的耐藥機制的主要觀點如下。

1．1 bcr/abl融合基因的點突變 目前認為，bcr/abl基因突變是甲磺酸伊馬替尼產生耐藥的常見機制。已檢測到的突變有100多種，可發生在ABL激酶的ATP結合環(P-環)、激活環(A-環)或在兩者之間的非催化區。點突變引起ABL激酶氨基酸改變，通過直接阻斷伊馬替尼與ABL激酶的結合或者妨礙ABL激酶失活構象的形成而干擾藥物與靶位點的結合，最終導致耐藥的發生。Kim［1］及 O'Hare等［2］對 70例伊馬替尼耐藥的CML患者進行研究，發現81個突變點，9例為多位點突變。其中，T315I位點(蘇氨酸變為異亮氨酸)突變率最高，其次為E255K、Y253H、G250E點突變，而且 Y253H、E225K、T315I和 F317L突變隨著CML疾病的進展出現頻率增加。

1．2 bcr/abl基因擴增及其表達增加 靶基因擴增和表達增加是許多抗腫瘤藥物耐藥原因之一。Weisberg等［3］采用伊馬替尼藥物濃度遞增法誘導小鼠前B淋巴細胞(Ba/F3-p210)(p210bcr/abl質粒轉染細胞)及K562細胞產生伊馬替尼耐藥，結果顯示Ba/F3-p210細胞耐藥機制為bcr/abl基因擴增，mRNA及p210蛋白高表達。而相同方法誘導的K562耐藥細胞未發現bcr/abl基因擴增，而僅僅有2～3倍的p210蛋白表達增加。

1．3 P糖蛋白的作用 P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)基因MDR1編碼的一種跨膜糖蛋白，由1 280個氨基酸構成，屬于典型的ABC(ATP-binding cassette)轉運蛋白超家族成員，能利用ATP水解釋放的能量主動將疏水親脂性化療藥物轉運至細胞外，導致細胞內藥物濃度低于殺傷濃度，從而使腫瘤細胞產生 MDR。Thomas等［4］采用14C標記伊馬替尼在P-gp陽性表達細胞系上證實伊馬替尼確實通過P-gp通道轉運出細胞外。

1．4 白血病干細胞的影響 Holtz等［5］研究指出，CML的白血病干/祖細胞對伊馬替尼不敏感，伊馬替尼并不能有效抑制其增殖并誘導其凋亡。房佰俊等［6］和 Fang 等［7］在對 bcr/abl+Flk1+CD31-CD34-細胞的研究中進一步證明，伊馬替尼對分化成熟或相對成熟的白血病細胞具有明顯的生長抑制作用，但對CML的原始白血病干細胞則可能是部分、甚至是完全耐藥的。

1．5 蛋白酶體的參與 齊靜［8］在對K562及伊馬替尼耐藥株K562/G0l細胞進行差異蛋白組學分析時，揭示出包括蛋白酶體在內的10個蛋白與白血病伊馬替尼耐藥相關，在后續實驗中證實了蛋白酶體確實參與了白血病細胞對伊馬替尼耐藥的發生，并闡明蛋白酶體通過增加IκB抑制因子的降解，促進藥物作用下核因子κB的核轉位和活化以及加速伊馬替尼作用靶蛋白bcr/abl的更新，使白血病細胞對伊馬替尼產生耐藥。

1．6 其他蛋白酪氨酸激酶的作用 近來發現Src家族中的Lyn激酶能調節伊馬替尼治療CML的敏感性，并且在伊馬替尼治療失敗并未出現bcr/abl突變情況的患者體內發現持續的Lyn激酶活性。研究顯示，Lyn不僅影響CML疾病的進程，而且在bcr/abl沒有突變的CML中能夠保持組成性活化而影響細胞對伊馬替尼的敏感性［9］。

1．7 其他耐藥機制 ①JAK激酶/信號轉導和轉錄激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)通路的作用。JAK/STAT是bcr/abl的眾多下游信號途徑之一。有研究發現［10］，JAK2抑制劑 AG490對伊馬替尼耐藥細胞32Dp210-T315I的抑制作用比伊馬替尼敏感細胞32Dp210更顯著，可能在耐藥細胞中JAK/STAT通路占主要地位。②蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)的異常表達。有研究表明，在許多惡性腫瘤如子宮內膜癌、肝癌、前列腺癌、結直腸癌、濾泡狀甲狀腺癌、肺癌和白血病中，磷酸化AKT呈持續高度活化，而且AKT的異常表達與這些腫瘤細胞的增殖、凋亡以及對放化療產生的耐受性密切相關。

2 逆轉耐藥的策略

2．1 增加用藥量 研究顯示［11］，先前采用400 mg/d伊馬替尼治療產生血液學和細胞遺傳學耐藥的患者接受800 mg/d伊馬替尼治療后，65%達完全血液學緩解，18%達完全細胞遺傳學緩解。先前未使用過伊馬替尼的慢性期患者使用800 mg/d伊馬替尼后有66%達完全細胞遺傳學緩解。Kantarjian等［12］研究表明，增加伊馬替尼劑量可以克服一些患者的血液學或細胞遺傳學的耐藥，但僅對低水平的伊馬替尼耐藥有效(如H386P型突變)，對高水平突變(如T315I或E255K)則無效。

2．2 第二代及第三代酪氨酸酶抑制劑 尼羅替尼及達沙替尼均為第二代酪氨酸激酶抑制劑。Ⅰ、Ⅱ期多中心臨床試驗證明［13］，尼羅替尼和達沙替尼對于各期伊馬替尼耐藥和伊馬替尼不耐受的CML患者都顯示出顯著的臨床療效，其安全性和耐受程度也是可以接受的。尼羅替尼是選擇性ABL激酶抑制劑屬伊馬替尼的衍生物，其活性強于伊馬替尼30～100倍，對大多耐伊馬替尼的突變有效但不能抑制Src家族激酶和T315I突變。Le Coutre等［14］報道了尼洛替尼治療伊馬替尼耐藥或不耐受CML-AP(加速期)患者的療效。接受尼洛替尼治療(400 mg，bid)的119例CML-AP患者中獲得血液學緩解和細胞遺傳學緩解的患者分別為47%和29%，獲得血液學緩解和細胞遺傳學緩解的中位時間分別為1個月和2個月。12個月預期總生存率為79%。達沙替尼是一個Abl與Src家族雙向激酶抑制劑，對Abl/Src激酶有高度選擇性，對bcr/abl融合基因陽性細胞株的抑制作用比伊馬替尼強100～300倍，降低bcr/abl磷酸化活性的作用比伊馬替尼強1000倍。目前已報道的ABL激酶點突變超過100種，除T315I突變外，達沙替尼對其中許多突變都有臨床療效［15］。目前，達沙替尼已被美國美國食品藥品管理局批準用于治療伊馬替尼耐藥或不能耐受的CML患者。

第三代bcr/abl激酶抑制劑是Aurora激酶抑制劑，與第二代酪氨酸激酶抑制劑最大不同是具有ABLT315I突變特異結合能力，能克服T315I突變導致的耐藥，主要用于治療伊馬替尼及對第二代bcr/abl酪氨酸激酶抑制劑耐藥的T315I突變者。

2．3 逆轉MDR MDR是腫瘤細胞最重要的耐藥形式之一，它表現為細胞對一種抗腫瘤藥物出現耐藥的同時，對其他許多結構不同、作用機制不同的抗腫瘤藥物也產生耐藥性。齊靜等［16］采用反轉錄-聚合酶鏈反應及流式細胞術分別從mRNA及蛋白水平檢測了伊馬替尼耐藥細胞系K562/G01的MDR水平，發現K562/G01有15．67%MDR表達，MDR參與了伊馬替尼耐藥發生。隨著人們對MDR形成機制研究的深入，逆轉MDR的作用靶點也逐漸從P-gp本身轉向其編碼基因MDR1。目前，藥物對抗MDR1/P-gp介導MDR的方法有:①化療藥物合用P-gp抑制劑;②增加化療藥物脂溶性使藥物迅速被吸收;③調節信號通路，抑制P-gp表達等。

2．4 bcr/abl下游通路抑制劑 在bcr/abl的眾多下游信號途徑中，能作為靶點的包括JAK/STAT、PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK。靶向Ras途徑的藥物有法尼酰基轉移酶，如Lonafarnib，已經證實能成功地抑制野生型bcr/abl下游Ras信號途徑以及T315I突變細胞系，并且增強了伊馬替尼對早期慢粒原始祖細胞的細胞毒性［17］。在眾多PI3K/AKT信號抑制劑中，雷帕霉素和它的衍生物(RAD001)已被證實能提高伊馬替尼對bcr/abl過度表達的細胞和伊馬替尼耐藥細胞的抑制效應［18］。索拉菲尼是近年來研究較多的藥物。它是一種多激酶抑制劑，最初設計為Raf(絲裂原活化蛋白激酶信號轉導的關鍵調節者)激酶抑制劑，后來研究發現其能同時抑制其他多種酪氨酸激酶，如血管內皮生長因子、血小板衍化生長因子、受體酪氨酸激酶c-Kit、Fms樣酪氨酸激酶等多種受體酪氨酸激酶［19］。有研究顯示，索拉非尼聯合雷帕霉素、Bcl-2抑制劑GX15070可在體外誘導伊馬替尼耐藥細胞株凋亡［20］。

2．5 組蛋白去乙酰化酶抑制劑 體外和體內試驗證實，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACi)有廣泛的抗白血病細胞活性，包括阻斷細胞周期、抑制細胞增生、誘導細胞分化、激發細胞凋亡。迄今為止，多種HDACi(如辛二酰苯胺氧肟酸，曲古菌素A、丙戊酸鈉等)已進入血液系統惡性腫瘤和實體瘤臨床試驗階段，這些藥物不僅單獨使用可表現出抗腫瘤作用，有的還聯合其他藥物(如維甲酸等)起到協同作用，而且還能增強腫瘤細胞對放化療的敏感性，使部分腫瘤耐藥現象得到顯著改善［21］。Nguyen 等［22］報道，HDACi(如 vorinostat或entinostat)能增強新型酪氨酸激酶抑制劑KW-2449對伊馬替尼耐藥的細胞作用，誘導其凋亡，其作用存在著時間和濃度依賴性。Zhang等［23］研究還顯示，HDACi和伊馬替尼聯用可以有效地誘導對伊馬替尼耐藥的CML中靜止的前體細胞凋亡，還可以清除植入免疫缺陷大鼠體內的CML干細胞。HDACi可以有效清除接受酪氨酸激酶抑制劑治療的CML患者體內的白血病干細胞。因此，HDACi是一類很有發展前景的藥物。

其他方法如蛋白酶體抑制劑、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的抑制劑等均在研究中。

3 結語

甲磺酸伊馬替尼的耐藥機制相當復雜，不僅涉及融合基因本身的結果和表達異常，還涉及多個基因/蛋白以及傳導通路的異常，新的機制也在不斷地被提出，但目前仍未完全闡明其耐藥機制。相信隨著對其耐藥機制研究的不斷深入，對逆轉耐藥的研究也將進一步開展，這有助于進一步提高CML患者的生存質量及長期生存率，也有助于進一步揭示CML的發病機制。

［1］ Kim SH，Kim D，Kim DW，et al．Analysis of Bcr-Abl kinase domainmutations in Korean chronic myeloid leukaemia patients:poor clinical outcome of P-loop and T315I mutation is disease phase dependent［J］．Hematol Oncol，2009，27(4):190-197．

［2］ O'Hare T，Eide CA，Deininger MW．New Bcr-Abl inhibitors in chronic myeloid leukemia:keeping resistance in check［J］．Expert Opin Investig Drugs，2008，17(6):865-878．

［3］ Weisberg E，Griffin JD．Mechanism of resistance to the ABL tyrosine kinase inhibitor STI571 in BCR/ABL-transformed hematopoietic cell lines［J］．Blood，2000，95(11):3498-3505．

［4］ Thomas J，Wang LH，Clak RE，et al．Active transport of imatinib into and out of cells:implication for drug resistance［J］．Blood，2004，104(12):3739-3745．

［5］ Holtz MS，Slovak ML，Zhang F，et al．Imatinib mesylate(STI571)inhibits growth of primitive malignant progenitors in chronic myelogenous leukemia through reversal of abnormally increased proliferation［J］．Blood，2002，99(10):3792-3800．

［6］ 房佰俊，宋永平，林全德，等．慢性粒細胞性白血病干細胞抗伊馬替尼機制的初步分析［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(46):9263-9267．

［7］ Fang BJ，Zheng CM，Liao LM，et al．Identification of human chronic myelogenous leukemia progenitor cells with hemangioblastic characteristics［J］．Blood，2005，105:2733-2740．

［8］ 齊靜．白血病耐藥新機制、新靶點研究［D］．北京:中國協和醫科大學，2008．

［9］ Wu J，Meng F，Lu H，et al．Lyn regulates BCR-ABL and Gab2 tyrosine phosphorylation and c-Cbl protein stability in imatinib-resistant chronic myelogenous leukemia cells［J］．Blood，2008，111(7):3821-3829

［10］ 劉麗．AG490對慢性粒細胞白血病細胞增殖的影響及其機理研究［D］．長春:吉林大學，2010．

［11］ 王彥艷，沈志祥．伊馬替尼治療慢性粒細胞白血病的耐藥與對策［J］．中國實用內科雜志，2007，27(20):1586-1588．

［12］ Kantarjian HM，Talpaz M，O'brien S，et al．Dose escalation of imatinib mesylate can overcome resistance to standard-dose therapy in patients with chronic myelogenous leukemia［J］．Blood，2003，101(2):473-475．

［13］ 王璇，陳岷，申向黎，等．慢性粒細胞白血病的治療新進展［J］．中國藥房，2008，19(20):1585-1587．

［14］ Le Coutre P， Ottmann OG， Giles F， et al． Nilotinib(formerlyAMN107)，a high selective BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor，is active in patients with imatinib-resistant or-intolerant accelerated phase chronic myelogenous leukemia［J］．Blood，2008，111(4):1834-1839．

［15］ Quintas-Cardama A，Cortes J．Therapeutic options against BCRABL-T315I-positive chronic myelogenous leukemia［J］．Clin Cancer Res，2008，14(14):4392-4399．

［16］ 齊靜，彭暉，顧振倫，等．伊馬替尼耐藥的K562細胞系的建立及其生物學特性研究［J］．中華血液學雜志，2004，25(6):337-341．

［17］ J?rgensen HG，Allan EK，Graham SM，et al．Lonafarnib reduces the resistance of primitive quiescent CML cells to imatinib mesylate in vitro［J］．Leukemia，2005，19(7):1184-1191．

［18］ Dengler J，von Bubnoff N，Decker T，et al．Combination of imatinib with rapamycin or RAD001 acts synergistically only in Bcr-Abl positive cells with moderate resistance to imatinib［J］．Leukemia，2005，19(10):1835-1838．

［19］ 肖若芝，何程明，王立琳，等．索拉非尼聯合柔紅霉素對白血病K562細胞抑制作用［J］．中國病理生理雜志，2010，26(7):1356-1361．

［20］ Dong S，Kang S，Lonial S，et al．Targeting 14-3-3sensitizes native and mutant BCR-ABL to inhibition with U0126，rapamycin and Bcl-2 inhibitor GX15-070［J］．Leukemia，2008，22(3):572-577．

［21］ Glaser KB．HDAC inhibitors:clinical update and mechanism-based potential［J］．Biochem Pharmacol，2007，74(5):659-671．

［22］ Nguyen T，Dai Y，Attkisson E，et al．HDAC inhibitors potentiate the activity of the BCR/ABL kinase inhibitor KW-2449 in imatinib-sensitive or-resistant BCR/ABL+leukemia cells in vitro and in vivo［J］．Clin Cancer Res，2011，17(10):3219-3232．

［23］ Zhang B，Strauss AC，Chu S，et al．Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate［J］．Cancer Cell，2010，17(5):427-442．