肝癌干細胞的研究進展

高 楊(綜述)，李 立，冉江華(審校)

(昆明市第一人民醫院肝膽胰一科，昆明650011)

原發性肝癌是我國和某些亞洲地區常見的惡性腫瘤之一，其病死率在消化系統惡性腫瘤中居第三位，僅次于胃癌和食管癌。治療肝癌的傳統方法是通過手術切除、化療、放療等方法盡量去除已經存在的腫瘤細胞。然而，在這些常規治療之后，肝癌的復發和轉移仍然是難以避免的問題，即便是進行肝移植術移除整個病肝，這些問題還是難以得到控制，因此如何避免肝癌的復發與轉移仍然是現今需要面對的嚴峻考驗。近年來“干細胞”理論在腫瘤的研究方面引起了一些學者的關注，并且在多種惡性腫瘤中分離出了腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)，使CSC的理論逐漸形成。因此，人們也開始將肝癌的研究方向轉向了肝癌干細胞，隨之其它成為研究的熱點。

1 CSC的理論起源

傳統觀點認為腫瘤的發生是由于正常成熟細胞在生長發育過程中某些特殊結構的消失，DNA發生突變，使正常細胞的生長、繁殖及凋亡發生失控，幼稚細胞大量增生，從而發生腫瘤。1983年，Mackillop等［1］提出了一種新的理論“腫瘤干細胞(CSC)”假說，認為在腫瘤中可能存在一部分具有類似干細胞功能特性的細胞，這一部分具有特殊功能的細胞能夠發育成腫瘤，并維持腫瘤的生物學特性。1997年Bonnet等［2］在血液系統的惡性腫瘤中發現并分離了此類細胞，證實了CSCs的存在。近年來，在許多實體腫瘤中(如乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等)發現有CSCs的存在。2008 年，Yang等［3］在肝癌組織中發現一種具有干細胞標志物CD90的細胞，此類細胞可以發育成腫瘤。在研究中幾乎所有肝癌組織標本和約91.6%的血液樣本中都含有表面標志為 CD45－CD90+的細胞，將這些細胞種植于免疫缺陷小鼠的皮下可以生成肝癌結節，證明了肝癌中同樣存在CSCs。CSCs具有普通干細胞或祖細胞一樣旺盛的繁殖能力和自我更新能力，正常干細胞的增殖分化受到自體基因的調控和許多外在因素的影響，處于一種動態平衡狀態。然而，CSCs分裂與分化不受這些因素的調控，不斷自我更新與分化繁殖，生產出大量不受抑制的腫瘤細胞，維持著腫瘤的生長與特異性［4］。

2 肝癌干細胞引起肝癌的發生

目前許多研究已經表明肝細胞肝癌中存在大量的干細胞。1999年，Wu等［5］研究發現，28%～50%的肝細胞肝癌中具有干細胞的免疫表型標志(如CK7、CK19等)。當肝癌細胞高表達干細胞表面標志物時，腫瘤切除或是肝移植都將有較高的腫瘤復發轉移率。組織學和免疫學的研究也都表明，肝癌的發生是由于某種干細胞發育而來。Roskams［6］的研究顯示，約有55%的癌前肝臟不典型增生或是癌前病變都含有大量的干細胞。Chiba等［7］從人類肝細胞肝癌Huh7和PLC/PRF/5兩系中提取到了同時具有肝細胞和膽管細胞系特點的側群細胞，將這些細胞種植到重癥聯合免疫缺陷鼠的體內能夠成瘤，并具有高度侵蝕轉移性，但在Hep2和Huh6這兩個肝癌細胞系中未檢測到側群細胞。近年來多項研究表明側群細胞具有CSCs的特性。

3 側群細胞和肝癌干細胞

1996 年，Goodell等［8］利用煙酸己可堿 33342 熒光染色檢測小鼠骨髓造血干細胞時發現，有些細胞核不著色或著色程度很低，表示極少數的細胞能將此熒光染料排出，且這群細胞在流式二維分析點陣圖上呈彗星狀分布在細胞主群的一側，因此將這群細胞稱為側群細胞。在正常組織中，側群細胞表達的基因與干細胞相似，都具有多向分化的潛能。因此，側群細胞被認為具有與干細胞相似的特性。人們開始對側群細胞表現出極大的興趣，隨著研究的深入，研究者發現側群細胞能將煙酸己可堿33342染料排出，這可能與細胞膜上的一種三磷酸腺苷結合蛋白［ATP-binding cassette superfamily G(White)member 2，ABCG2］運載體有關。Zhou 等［9］發現側群細胞表型的形成與ABCG2有著最直接的聯系，側群細胞高表達ABCG2有利于排除毒素。側群細胞還具有自我更新和多向分化潛能，同樣在一些腫瘤細胞系中，側群細胞具有較高的自我更新和無限增殖的能力。Szotek等［10］從鼠卵巢癌細胞系MOVCAR7和4306中分離出側群細胞，這些側群細胞體外培養能產生側群細胞和非側群細胞，與正常組織相比側群細胞比例明顯高于非側群細胞。Chiba等［7］進行的實驗中也幾乎得到同樣的結果。側群細胞不僅有發展成腫瘤的潛在能力，還能通過外排機制抵抗化療藥物，這些細胞可能在維持腫瘤的生長和復發中起著重要的作用。Shi等［11］研究表明肝癌標本中存在側群細胞，其比例與肝癌術后早期轉移復發率密切相關。因此，側群細胞雖不等同于肝癌干細胞，但側群細胞至少包含了部分肝癌干細胞。

4 肝癌干細胞的標志物

人們研究肝癌干細胞的生物學特性首先需要將其分離鑒定出來。在這過程中學者們嘗試使用了多種表面標志物。目前，側群細胞也作為鑒定肝癌干細胞的方法之一，但它并不十分理想。其原因是:①不是所有的肝癌細胞系中都能分離出側群細胞;②煙酸己可堿33342具有DNA毒性，利用煙酸己可堿33342分選后的細胞難以辨別生物學特性是否發生改變。由于煙酸己可堿33342的排出與ABCG2有關，因此，ABCG2可替代側群細胞分選法作為肝癌干細胞標志。

同時，學者們開始利用各種細胞表面單克隆抗原標志物對肝癌干細胞進行鑒定分離。在肝臟的發生過程中，CD90表達于肝臟干細胞或祖細胞表面，而在成人的肝臟中表達卻十分稀少。目前，CD90已被認為是一種肝癌干細胞的表面標志物，這一觀點在肝癌種植于聯合免疫缺陷鼠的實驗中得到證實。Yang 等［12］證實細胞也是一種敏感而特異的CSCs，可用于肝癌的早期診斷，并可用于肝癌的靶向治療。Ma等［13］證實CD133作為一種跨膜糖蛋白，也是一種極有價值的表面標志物，表達于1%～5%的人肝細胞肝癌，而在正常肝組織中沒有表達，并且和其他的肝癌細胞以及正常肝細胞相比，的細胞具有較大的形態。

除了這些單克隆抗原外，許多學者已經開始研究CSCs的生物學特征和腫瘤發生過程中的信號通路，以此作為鑒定分離肝癌干細胞的方法。Ma等［14］通過研究發現在的肝癌細胞中蛋白激酶B和B細胞淋巴瘤/白血病2兩個信號通路被激活可能提高肝癌的耐藥性，如果兩種信號通路被阻斷就可以提高肝癌對化療的敏感性。Yamashita等［15-17］發現，上皮細胞黏附分子陽性的細胞與肝癌干細胞的大多數特性相同，而上皮細胞黏附分子基因的表達是通過Wnt/β連環蛋白通路來實現的。因此，如果阻斷Wnt/β連環蛋白通路，肝癌的發生、發展就有可能受到抑制。Yang等［18］從肝癌中分離出具有肝臟干細胞表面標志物OV6+，發現這些細胞具有很強的成瘤能力，同時對化療也十分不敏感。Tang等［19］研究發現，人類肝臟干細胞中轉化生長因子β單次跨膜蛋白激酶受體Ⅱ和胚胎肝臟胞襯蛋白參與組成轉化生長因子β信號途徑，說明了轉化生長因子β信號的構成成分與肝癌的發生、發展有關。轉化生長因子β信號通路被阻斷或白細胞介素6信號通路活化可能引發肝癌的形成。

雖然目前學者們通過研究已發現很多能夠鑒定分離肝癌干細胞的標志物，但仍沒有一種標志物能夠單一地被利用來準確鑒別所有肝癌干細胞。

5 肝癌干細胞的應用

5.1 肝癌干細胞對放化療不敏感的原因 由于傳統的治療方法很難避免肝癌的復發轉移，故人們開始將目光轉向了肝癌的起始細胞“肝癌干細胞”。由于它們對放療化療都不敏感，用傳統的方法很難殺滅這些CSCs。其原因是:①CSCs可使晚期的腫瘤增加B細胞淋巴瘤/白血病2蛋白家族的水平和三磷酸腺苷結合盒轉運的活性，所以肝癌極易復發，同時對化療十分不敏感［20］。②CSC的基因具有不穩定性，Woodward等［21］通過對神經膠質瘤干細胞的研究發現Wnt/β連環蛋白可使細胞的基因極不穩定，對放射性治療發生抵抗。③腫瘤對放射性治療的抵抗，Clement等［22］研究發現在 CSCs自我更新和發育成腫瘤過程中，由于Notch和Hedgehog-Gli1信號途徑的參與，使得腫瘤對放射性治療發生抵抗。

5.2 肝癌干細胞的治療策略 目前，針對CSC的新治療措施主要有誘導CSCs分化成非腫瘤細胞或者抑制這些細胞的自我更新［23］，靶向針對CSCs使之對放化療敏感和抑制血管增生等［20］。許多信號途徑參與了正常干細胞的消亡和自我更新減低，同時促進了CSCs的增殖。例如，Hedgehog信號途徑就決定了神經祖細胞的死亡和自我更新［23］。Berman 等［24］發現在胰腺癌中常常發生Hedgehog信號途徑紊亂，而應用一種小分子Hedgehog信號途徑阻斷劑“環杷明”減低乙醛脫氫酶(一種CSCs標志)可以達到治療胰腺癌的目的。Cheng等［25］利用某種特殊的γ分泌酶抑制劑抑制了Notch途徑，發現CSCs的自我更新受到抑制，同時腫瘤的生長也隨之減慢。許多學者發現利用小干擾RNA或者其抗體，可以抑制β連環蛋白活化T細胞因子基因及轉錄輔激活蛋白的能力達到阻滯Wnt途徑的目的，使腫瘤的生長受到抑制，學者們還發現使用維生素D也能達到同樣的效果［26，27］。Tang 等［19］對肝細胞肝癌的研究顯示，與正常細胞相比，肝癌干細胞丟失了表達轉化生長因子β單次跨膜蛋白激酶受體Ⅱ和胚胎肝臟胞襯蛋白的基因，肝癌的發生與轉化生長因子β途徑受抑制或白細胞介素6的活化有關。因此，白細胞介素6很可能是治療肝癌的重要靶點。Wallner等［28］利用去睪丸小鼠研究前列腺癌時發現白細胞介素6信號途徑被抑制可以阻礙CSCs的自我更新，同樣的現象在肝癌中也得到證實。Miletti-González等［29］研究發現 CD44在腫瘤和非腫瘤細胞上的表達是不同的，因此，認為未來對肝癌的治療可利用特殊抗體抑制具有特殊表面標志的靶細胞。利用全反式維甲酸可以將CSCs細胞誘導分化成低侵蝕性且分化程度較高的細胞，該方法已經在治療急性早幼粒性白血病中得到應用，并取得很好效果。然而，CSCs對維甲酸等分化誘導劑的效果具有不確定性，也有可能導致不良的誘導效果。如利用維甲酸治療某些乳腺癌時乳腺癌干細胞反而會分化成具有腫瘤基因表型的血管［30］。利用分化誘導療法將肝癌干細胞向正常細胞方向誘導將是一種非常有前景的方法，但這一方法的實際應用還有待于鑒定肝癌干細胞的方法和分化誘導技術的進一步提高。

改變CSCs生長的微環境也是一項有效的治療手段。Adams等［31］認為CSCs只有在特定的生長環境中才能不斷自我更新，發育成腫瘤。利用甲狀旁腺激素在實驗室中改變CSCs的微環境可以改變CSCs 的發展方向［32］。Martínez-Iglesias 等［33］發現人類胚胎干細胞來源的成纖維細胞樣細胞通過分泌胰島素樣生長因子2來支持CSCs生長的微環境。因此，通過靶向作用于胰島素樣生長因子2可以改變CSCs生長的微環境，從而達到治療的目的。然而，這種治療措施是否對肝癌有效還需進一步的研究。

6 展望

CSCs已經成為目前腫瘤研究的熱點，為腫瘤的治療提供了新的思路。肝癌干細胞的發現是在肝癌研究方面的一個重大突破，為臨床診斷和治療肝癌提供了新的線索。肝癌的發生、發展與肝癌干細胞的自我更新特性和分化能力密切相關。進一步了解肝癌干細胞的特性、發展規律、鑒定方法及生長環境的特殊性有助于發現針對肝癌干細胞診斷篩查方法以及特效的治療手段。

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