細菌生物膜的防治進展

丁進亞，黃前川(綜述)，曹軍皓(審校)

(廣州軍區武漢總醫院檢驗科，武漢430070)

生物膜是微生物細胞(如細菌、真菌、原蟲)及其產生的細胞外大分子多聚物所形成的一種特殊細菌群落，具有高度的組織化。生物膜的形成是一個動態過程，包括可逆性黏附、不可逆性黏附、微菌落形成、生物膜成熟和解聚等階段，任何一階段的異常都將影響生物膜的形成。

1 抗菌生物材料

細菌在材料表面黏附是生物膜形成的第一步，阻止細菌在材料表面黏附將有效抑制生物膜的形成。

1.1 聚乙二醇 改變生物材料表面物理化學性質包括:使材料表面極度親水或疏水;使材料表面帶更多的負電荷;在材料表面涂附白蛋白及肝素等都能有效防止細菌在材料表面的黏附多種方式。在眾多的生物材料中，聚乙二醇是目前所知的最為親水的聚合物，具有很大的排斥體積以及很大的反滲透壓，產生很強的抗細菌黏附的能力，常常被用來做表面改性劑［1，2］。經聚乙二醇涂附的生物材料，對大多數革蘭陰性菌有很好的抗菌作用［3］，對金黃色葡萄球菌的黏附抑制力也可達到89%～93%［4］。

1.2 重金屬或生物活性分子 銀的抗菌譜非常廣，利用納米銀或納米鹵化銀涂附生物材料具有很好的抗感染性［5，6］。除了銀可以作為抗菌劑外，其他重金屬或其氧化物也可使材料產生抗菌性能，如納米金、納米TiO2、ZnO等［7］。另外，還可采用生物活性分子針對性地抑制某些細菌的生長，比如金黃色葡萄球菌是生物材料相關的主要致病菌之一［8］，將絲氨酸蛋白酶涂附在心血管滌綸生物材料上，可顯著降低金黃色葡萄球菌的黏附因子的作用，有效地抑制生物膜的形成，其抑制作用的強度與絲氨酸蛋白酶劑量呈正相關。可見絲氨酸蛋白酶等生物活性分子在抗菌生物材料制備具有很好的前景［9］。

1.3 陽離子表面活性分子 陽離子表面活性分子季銨鹽具有廣譜的殺菌功能，帶長鏈烷基的季銨鹽的殺菌機制為:首先，帶正電荷的N+吸附在表面帶負電荷的細菌表面;然后，長鏈烷基刺入細菌的細胞膜，使細菌的內容物外瀉而使細菌死亡。其特點是物理殺菌，所以這種殺菌性能是持久的、可恢復的。將季銨鹽固定在材料表面，使材料具有殺菌功能而防止細菌生物膜的形成［10］，含有雙鍵的季銨鹽與甲基丙烯酸羥乙酯的材料共用于齒科修復，具有良好的抗菌性能，有研究［11］將含有長鏈烷基的季銨鹽接枝在硅橡膠并進行了體外和體內動物試驗，都獲得了滿意的抗感染效果。

2 阻止細菌間相互作用，抑制生物膜形成

細菌在生物膜過程中通過正反饋方式產生分泌一些特定的自誘導信號分子N-酰基高絲氨酸內酯調控致病基因的表達，在N-酰基高絲氨酸內酯的作用下，細胞產生大量的胞外多糖，形成微菌落，不斷增厚的微菌落最終形成成熟的生物膜，這一過程稱為群體感應［12，13］。可見，阻止細菌間的相互作用，將利于防止生物膜的形成。

2.1 抑制細菌的群體感應 不同的細菌存在不同的群體感應系統，如葡萄球菌有Agr(accessory gene regulator)群體感應系統、銅綠假單胞菌有lasR、rhlR和rhlL群體感應系統，N-酰基高絲氨酸內酯作為群體感應信號，除了參與生物膜的合成外，還與細菌毒性因子的產生、抗生素的合成或降解、質粒結合轉移等多種生物功能相關，并可以誘導宿主細胞的凋亡［14］，是導致持續或反復感染的重要分子。Schaber等［15］報道不產生N-酰基高絲氨酸內酯信號分子的銅綠假單胞菌群體感應缺陷株，不僅毒力因子表達水平降低，而且不能在非生物表面形成生物膜。Dong等［16］用RNA干擾銅綠假單胞菌N-酰基高絲氨酸內酯合成相關基因lasR、rhlR和rhlL后，顯著促進成熟的生物膜解體，進一步證實了N-酰基高絲氨酸內酯在生物膜形成中的關鍵作用。實際上，銅綠假單胞菌本身就可以表達N-酰基高絲氨酸內酯信號分子抑制劑，該抑制劑具有很高的穩定性，耐酸堿，非常適合用于治療與預防燒傷患者因銅綠假單胞菌引起的各種急慢性感染。如何促進細菌釋放自身N-酰基高絲氨酸內酯信號分子抑制劑將是抗感染研究的方向之一。目前藥物抑制N-酰基高絲氨酸內酯的研究已經取得一定的進展，實驗發現氨溴索下調銅綠假單胞菌群體感應系統信號分子N-酰基高絲氨酸內酯以及N-酰基高絲氨酸內酯合成酶編碼基因的表達，明顯抑制野生型銅綠假單胞菌黏附及細菌生物被膜形成，并能增加抗生素對細菌生物被膜的滲透作用［17］，對成熟的細菌生物被膜結構還有破壞作用［18］。因此，抑制病原細菌的群體感應信號途徑將成為控制感染和合成新型抗菌藥物的重要手段。

2.2 抑制細胞外多糖的合成及功能 細胞外多糖是生物膜的結構基礎和保護屏障，加強細菌對固體表面的黏附［19］，并且抑制單核巨噬細胞的吞噬作用，大多數抗生素難以透過凝膠樣的胞外多糖層，臨床抗感染治療常常失敗，致使感染反復發作或成為難治性慢性炎癥。可見減少胞外多糖的分泌將抑制生物膜的形成，同時利于機體免疫系統對病原菌的清除。大蒜素是臨床上用于抗真菌感染的常見藥物，主要是通過氧化含有巰基的蛋白質使之滅活。林麗華等［20］證實，大蒜素可以干擾細菌胞外多糖的合成，高濃度大蒜素組和低濃度大蒜素組銅綠假單胞菌的黏附率明顯低于生理鹽水對照組;熒光顯微鏡定性角度也顯示同樣結果，隨著大蒜素濃度的增加，其黏附抑制作用增強，使得生物膜的合成能力降低，說明胞外多糖影響細菌的早期黏附作用。以上結果為臨床應用大蒜素治療難治性銅綠假單胞菌生物膜感染提供了有力的實驗室依據。然而，大蒜素是否通過抑制銅綠假單胞菌巰基酶而影響生物膜形成還需要進一步的探討。細胞外多糖最重要的毒力因子是藻酸鹽，在細菌的黏附和多層次生物膜結構的形成中具有關鍵作用。國內外均報道［21，22］，抑制藻酸鹽的作用可以控制生物膜的合成，抗藻酸鹽抗體中和細菌藻酸鹽后可以降低其黏附性，使細菌聚集過程受阻，同時影響細菌生物被膜構建和形態，使生物被膜合成下降;與抗菌藥物聯合應用后，能夠增強抗生素對于生物被膜的滲透性和對細菌的殺菌活性，從而對生物膜相關感染起到防治作用。

2.3 調控二價陽離子濃度 多種二價陽離子影響著生物膜的形成，觀察發現低濃度鐵促進鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌、副球菌等多種細菌生物膜的合成，高濃度鐵卻抑制細菌生物膜的合成［23，24］;而鈣、鎂、錳、銅等陽離子對生物膜的合成作用與鐵離子相反，降低游離鈣的水平可使多耐藥鮑曼不動桿菌在人體呼吸道上皮細胞或塑料表面的黏附及生物膜的形成能力顯著降低［25］，而在富含鈣離子培養基中的銅綠假單胞桿菌生物膜厚度是不含鈣離子培養基的10倍［26］。目前認為，高濃度的鈣離子可以穩定和促進細胞外多糖的釋放，增加生物膜結構的聚集性和抑制生物膜的分解的功能［27］。因此，控制二價陽離子濃度將影響細菌生物膜的形成，乙二胺四乙酸是最常用降低游離陽離子的金屬螯合劑，當細菌脂多糖中的陽離子結合乙二胺四乙酸后，不僅促進生物膜中細菌脂多糖的釋放和藥物的滲透性，抑制生物膜的形成，而且使成熟生物膜穩定性降低并產生產生裂解作用，乙二胺四乙酸聯合慶大霉素可以完全殺滅生物膜中的細胞［28］。

2.4 環鳥苷二磷酸信號途徑 環鳥苷二磷酸是原核細胞信號轉導中一類新的第二信使，它的作用涉及生物膜的形成、毒力因子的表達、細胞間的通訊、激發免疫系統的應答等多個方面，是細菌生存和代謝的關鍵性調節因子之一。

已經證實環鳥苷二磷酸通過調控細菌運動器官鞭毛的表達和功能以及細胞外多糖的合成，影響霍亂弧菌、銅綠假單胞菌、水稻白葉枯病菌等的生物膜形成。有研究對外源性環鳥苷二磷酸在生物膜形成中的作用進行了深入研究，他們用200 μmol/L的環鳥苷二磷酸與等量的生理鹽水分別作用于變形鏈球菌在新鮮牙釉質片上形成的生物膜，在掃描電鏡下觀察發現:環鳥苷二磷酸處理組生物膜形成能力低于生理鹽水組的50%，細菌排列無明顯規律;同時檢測細胞外多糖、細菌黏附和產酸能力均明顯下降。研究證明，變形鏈球菌內部存在環鳥苷二磷酸信號通路，該通路介導變形鏈球菌的生物膜形成及在離體牙釉質表面的黏附;外源性環鳥苷二磷酸具有降低變形鏈球菌生物膜的形成，產酸、耐酸、體外黏附等特性;單獨或與其他的抗齲制劑聯合應用有望成為一種新型防齲方法［29］。該研究提示外源性環鳥苷二磷酸對生物膜的防治具有作用。

2.5 其他 有些特定的蛋白或多肽可直接抑制或破環生物膜的形成，如大腸埃希菌小蛋白Hha通過阻止細菌菌毛基因fimA和ihfA的轉錄而顯著減少生物被膜的形成;抗菌肽Kappacin和生物膜退化酶則可清除成熟生物被膜內的細菌和生物被膜基質，細菌清除最高效率可以達到99%［30］。這些研究盡管還局限于體外實驗，但為生物膜感染的防治提供了重要的理論依據。

3 展望

細菌生物膜是細菌生長過程中為適應生存環境而形成的一種存在形式，具有極強的耐藥性和抵抗機體免疫系統的能力，成為臨床上難治性感染的重要原因之一。其形成和發展的各個環節都可能成為治療的靶位，目前生物膜防治的研究成果已經開始運用于臨床，例如用枸櫞酸鈉降低游離鈣、鎂離子，在預防留置導管引起的生物膜感染中就有很好的臨床效果［31］。今后防治生物膜感染的研究方向應該不只集中在如何阻止生物膜的形成，還應該努力研發對成熟生物膜具有分解或強穿透力的抗菌藥物。

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