CX3 CL1/fractalkine 在肺動脈高壓過程中的表達變化及葛根素的干預作用*

狄 楓， 王良興， 沈巨信， 高偉紅

(1 紹興市人民醫院呼吸內科，浙江 紹興312000;2溫州醫學院附屬第一醫院肺科中心，浙江 溫州325000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種具有氣流受限特征的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進行性發展，與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關［1］，肺動脈高壓是其終末階段。肺動脈高壓的動物模型已經證實促炎因子和一些趨化因子與肺動脈高壓的發生有關［2，3］。CX3CL1(fractalkine，FKN)是趨化因子CX3C 亞族里的唯一成員，也是唯一的一種既有可溶形式也有膜結合形式的趨化因子，既有趨化性蛋白的功能也有細胞黏附分子的功能。本實驗在野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠模型上，觀察FKN 的表達情況，探討FKN 在肺動脈高壓形成過程中的作用和可能的機制，以及觀察葛根素的治療效果。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 清潔級標準健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠30 只(溫州醫學院實驗動物中心提供)，體重(body weight，BW)270－310g，在恒溫26℃，相對濕度50%－60%清潔環境中飼養。

1.2 試劑和藥品 野百合堿(monocrotaline)購于日本和光純藥工業株式會社，葛根素(puerarin)由浙江康恩貝制藥股份有限公司出品(批號為090103;規格:2 mL∶0.1 g)，大鼠fractalkine ELISA 試劑盒購于晶美生物工程有限公司。RT－PCR試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司。免疫組化試劑購于北京中衫金橋生物技術有限公司。Fractalkine 兔抗大鼠多克隆抗體購自BioVision。其余試劑均為市售分析純試劑。

2 方法

2.1 動物模型制備及分組 將30 只大鼠，按隨機數字表法分為3 組:(1)溶劑對照組(C 組，10 只)，采用無水乙醇與生理鹽水2∶8 比例混合單次腹腔注射;(2)野百合堿模型組(M組，10 只)，采用上述溶劑配成的1. 0% 野百合堿溶液以50 mg/kgBW 的劑量單次腹腔注射后飼養3 周;(3)葛根素干預組(M+ P 組，10 只)，在注射野百合堿溶液后每晨以40 mg/kgBW 劑量腹腔注射飼養3 周。余飼養條件各組相同。動物飼養到規定時間后，稱量體重，以5%水合氯醛400 mg/kg 劑量腹腔注射麻醉，將聚乙烯導管(OD 1.1 mm，ID 0.8 mm)從右頸外靜脈插入右心室，記錄右心室壓力波形后插入肺動脈固定記錄肺動脈壓力波形，另一聚乙烯導管從左頸總動脈插入固定記錄頸總動脈壓力波形，ML870PowerLab 8/30數據記錄分析系統及MLS023Chart 軟件計算肺動脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)、右心室平均壓(mean right ventricle pressure，mRVP)和頸動脈平均壓(mean carotid arterial pressure，mCAP)。放血處死動物后，分離心臟，PBS 沖洗，10%中性甲醛液中固定后，把心臟剪開成右心室壁(right ventricle，RV)和左心室(left ventricle，LV)加室間隔(septum，S)兩部分，濾紙吸干液體后分別用電子天平稱重，計算兩者的比值RV/(LV+S)來反映右心室重量的變化。

2.2 光鏡標本制作及觀察 分離左肺組織，10%中性福爾馬林液中固定充分，左肺門水平橫切，制備石蠟包埋組織切片，厚度4μm，分別行HE 染色、醛品紅法彈力纖維染色，每只大鼠選1 張肺組織切片，每張切片隨機選取直徑(50－200)μm肺細小動脈各6 支(50－100 μm 2 只，100－150 μm 2 只，150－200 μm 2 只)，用Image－Pro Plus 6.0 軟件測定平均血管總面積(外彈力板以內)、血管腔面積(內膜表面以內)，計算肺細小動脈管壁面積(vessel wall area，WA)/管總面積(total area，TA)(WT/TA)，并測定肺細小動脈內外彈力板之間的中膜厚度(thickness of pulmonary artery media，PAMT)。

2.3 血漿可溶性fractalkine(sFKN)測定 應用ELISA 試劑盒檢測大鼠血漿sFKN 水平，實驗步驟按試劑盒說明書進行。根據標準品吸光度值用SPSS 11.5 軟件擬合繪制標準曲線，通過標本吸光度值計算出濃度。

2.4 RT－PCR 法檢測肺組織FKN mRNA 的表達 動物放血處死后，迅速取右下肺新鮮組織，無菌去酶1 ×PBS 水洗去血污，即刻置液氮中保存。Trizol 一步法提取組織RNA 并純度鑒定及定量，使其終濃度為1 g/L。反應在200 μL PCR 薄壁管(RNase free)中進行。FKN 上游引物5'－CCCTGAGACACCCGTTTC－3'，下游引物5'－AGTGACTATTCATGTTGATAAGGG－3，目標片段524 bp;GAPDH 上游引物5'－TTCCAGGAGCGAGATCCC－3'，下 游 引 物5'－CAGGGGGGCTAAGCAGTT－3'，目標片段252 bp。擴增條件為94 ℃30 s→54 ℃30 s→72 ℃1 min，熱循環30 次，72 ℃5 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后Gel－Pro Analyzer 軟件分析，FKN mRNA/GAPDH mRNA 的比值即為FKN mRNA 的相對含量，每個樣本重復3 次實驗，取其平均值。

2.5 FKN 免疫組織化學檢測 肺組織經10%中性甲醛液充分固定后。常規脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后抗原修復，Ⅰ抗為FKN 兔抗大鼠多克隆抗體，Ⅱ抗為山羊抗兔的IgG抗體－HRP 多聚體，0.05%DAB－H2O2顯色，蘇木素淡染細胞核，脫水透明后中性樹膠封片。不滴加Ⅰ抗的片子作為陰性對照，陽性結果呈棕黃色，每只大鼠選1 張肺組織切片，每張切片隨機選取直徑為50－200 μm 的肺細小動脈5 支，用Image－Pro Plus 6.0 軟件測定管壁平均吸光度(A)反映肺動脈壁上FKN 的相對含量。

3 統計學處理

結 果

1 形態學檢查

光鏡下示C 組肺細小動脈內皮細胞扁平連續，內彈力板自然彎曲，平滑肌層未見明顯增厚，管壁均勻一致。M 組肺細小動脈內皮部分脫落，血管肌化明顯，內彈力板進一步扭曲甚至斷裂，管壁明顯增厚，部分小動脈閉塞，血管周圍以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤明顯，部分成團。M +P 組肺細小動脈較M 組血管肌化減輕，內彈力板扭曲減少，管壁增厚好轉，管腔狹窄不明顯，血管周圍炎性細胞減少，見圖1。

Figure 1. Pulmonary arteriole of rats in each group. A:control group;B:monocrotaline model group;C:monocrotaline +puerarin group (HE staining，×400)圖1 各組肺細小動脈HE 染色

Figure 2. RT－PCR electrophoresis strip of FKN in lung tissues圖2 各組大鼠肺組織FKN m RNA 表達

2 各組大鼠mPAP、mRVP 、mCAP、RV/(LV +S)%、WA/TA 和PAMT 的比較

M 組mPAP、mRVP 、RV/(LV+S)、WA/TA 和PAMT 均顯著高于C 組，說明大鼠肺動脈壓力增高，右心室肥大，血管壁增厚，證實模型制造成功。M + P 組RV/(LV + S)、WA/TA、PAMT 較M 組顯著降低。M+P 組mPAP 和mRVP 與M 組比較有降低趨勢，但無顯著差異。反映體循環的頸動脈平均壓(mCAP)在各組之間無顯著差異(F=0.633，P ＞0.05)，見表1。

3 各組大鼠血漿sFKN 濃度、肺組織FKN mRNA 相對含量及肺動脈壁膜結合型FKN 表達比較

M 組血漿sFKN 濃度、肺組織FKN mRNA 含量和肺動脈壁FKN 蛋白含量大于C 組，M+P 組的這些指標均小于M 組，差異顯著，見表2。

表1 各組大鼠mPAP、mRVP 、mCAP、RV/(LV+S)、WA/TA 和PAMT 比較Table 1. Comparison of mPAP，mRVP，mCAP，RV/(LV+S)，WA/TA and PAMT in the three groups(±s.n=8)

表1 各組大鼠mPAP、mRVP 、mCAP、RV/(LV+S)、WA/TA 和PAMT 比較Table 1. Comparison of mPAP，mRVP，mCAP，RV/(LV+S)，WA/TA and PAMT in the three groups(±s.n=8)

1 mmHg=0.133 kPa;＊＊P ＜0.01 vs C group;##P ＜0.01 vs M group.C:control:M:monocrotaline model;M+P:monocrotaline+puerarin.

Group mPAP(mmHg) mRVP(mmHg) mCAP(mmHg)RV/(LV+S)(%) WA/TA PAMT(μm)C 90 0.45 ±0.07 13.91 ±1.51 M 26.04 ±5.03＊＊ 22.17 ±5.63＊＊ 83.54 ±13.08 59.52 ±12.86＊＊ 0.87 ±0.04＊＊ 36.48 ±3.81＊＊M+P 22.34 ±3.76 21.42 ±2.98 79.33 ±16.38 40.32 ±5.24## 0.69 ±0.08## 26.12 ±3.40 12.93 ±1.93 11.66 ±1.81 76.08 ±9.57 23.33 ±2.##

表2 各組大鼠血漿sFKN 濃度、肺組織FKN mRNA 相對含量和肺動脈壁膜結合型FKN 的變化Table 2. Changes of sFKN in plasma，FKN mRNA in lung tissue and FKN protein in pulmonary artery wall in each group(±s.n=8)

表2 各組大鼠血漿sFKN 濃度、肺組織FKN mRNA 相對含量和肺動脈壁膜結合型FKN 的變化Table 2. Changes of sFKN in plasma，FKN mRNA in lung tissue and FKN protein in pulmonary artery wall in each group(±s.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs C group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs M group.

Group sFKN(ng/L)FKN mRNA/ GAPDH mRNA FKN protein C 412.09±57.38 0.11±0.06 0.171±0.010 M 1 078.02±254.05＊＊ 0.64±0.04＊＊ 0.198±0.019＊＊M+P 465.17±188.80## 0.28±0.08## 0.181±0.016#

4 血漿sFKN、肺組織FKN mRNA、肺動脈壁膜結合型FKN蛋白與PAMT、RV/(LV+S)相關性分析

sFKN 與PAMT 呈正相關(r =0.719，P ＜0.01)，與RV/(LV+S)呈正相關(r=0.685，P ＜0.01)，FKN mRNA 與PAMT呈正相關(r=0.882，P ＜0.01)，與RV/(LV+S)呈正相關(r=0.830，P ＜0. 01)，FKN 與PAMT 呈正相關(r =0. 599，P ＜0.01)，與RV/(LV+S)呈正相關(r=0.664，P ＜0.01)。

討 論

COPD 與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關，具有氣流受限的特征［1］。其發病的終末環節為肺動脈高壓的形成，而繼發的肺動脈高壓是COPD 發展至肺心病的關鍵病理環節，死亡率大幅度上升。肺動脈高壓的形成機制很復雜，目前觀點認為是各種內外環境的刺激因素作用于有遺傳易感性的個體，最終導致肺小動脈異常收縮和血管重建，使肺動脈壓力增高。近年來對炎癥與血管炎、血管硬化的研究方興未艾，近期研究認為動脈粥樣硬化是一種由各種原因損傷內皮細胞導致的特殊形式的動脈壁慢性炎癥［4］，很多實驗也都已經觀察到在肺動脈高壓的患者和動物模型肺血管的復合性損傷中，血管周圍炎性細胞如淋巴細胞和巨噬細胞的浸潤，說明炎癥細胞參與了肺動脈高壓中的血管損傷［5］。臨床上無明顯缺氧的輕度COPD 患者，甚至肺功能正常的吸煙者都已出現肺動脈內膜增厚和以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，說明炎癥在COPD 引起的肺動脈高壓過程中是初始因素，而這些白細胞的運輸包括滾動、黏附、外滲等運動都是在趨化因子的趨化作用下完成的。FKN 是近年來發現的唯一一種可以以膜結合形式和可溶性形式2 種形式存在的趨化因子，膜結合的FKN 受炎癥細胞因子(如TNF－α、IL－1、IFN－γ)的激活主要表達在內皮和上皮細胞表面，它本身具有整合蛋白的功能，介導的黏附可以是整合素非依賴途徑，膜結合形式不僅能介導俘獲快速血流中的CX3CR1 陽性白細胞并且還能激活它們［6－8］。但不同于其它的趨化因子，FKN在被溶蛋白性裂解后可以可溶性形式釋放［9］，在正常狀態下，可溶性FKN 的功能還不確定，在多種慢性炎癥疾病中可以觀察到血清FKN 的升高［10，11］，同時參與血管炎的病理過程［12］，在類風濕關節炎的病人中，伴有血管炎的患者血清FKN 的含量明顯高于不伴有血管炎的患者［13］，在韋格納肉芽腫病人血清中，FKN 含量明顯高于健康對照者。同時血清中FKN 含量的增高能增加外周血單核細胞CX3CR1 的表達，從而加強這些受體陽性細胞的趨化和黏附，這些變化直接導致血管內皮損傷［14］。體外研究發現sFKN 對單核細胞和T細胞呈現很好的趨化活性，指引這些細胞游走到特定的血管部位。由于其結構和功能的獨特性，FKN 越來越受到人們的關注，被認為在炎癥反應中單核細胞、T 淋巴細胞募集到血管壁的過程中起到了關鍵性的作用。CX3CR1 在嚴重原發性肺動脈高壓患者體內循環T 細胞上表達上調，特別在CD4 陽性的T 細胞亞群，血漿中可溶性的FKN 濃度較對照組增高，肺組織FKN mRNA 的表達較對照組有顯著增高［15］。我們的實驗在肺動脈高壓的大鼠模型上也觀察到肺組織和肺動脈壁上的FKN 表達增加，血漿中可溶FKN 增加。

葛根素系豆科植物野葛干燥根中的提取物，其主要成分為8－D－吡喃葡萄糖－4，7－二羥基異黃酮苷，具有擴張血管、抗凝、改善微循環、清除氧自由基、抑制平滑肌細胞增生等作用［16］。近年來發現葛根素還能抑制組織缺血再灌注損傷后炎癥細胞聚集和炎癥級聯反應［17］，另有研究證明葛根素能有效改善慢性低氧性肺動脈高壓大鼠的肺血管重建、降低肺動脈高壓及右心室肥大［18，19］，但具體機制尚不完全清楚。本實驗在野百合堿誘導的肺動脈高壓模型中觀察葛根素對肺動脈高壓的干預效應，發現葛根素干預組RV/(LV +S)有明顯下降，mCAP 無改變，提示葛根素可以抑制野百合堿誘導的右心室重構的發展，而對體循環無明顯影響，同時光鏡下發現葛根素可以抑制肺細小動脈WA/TA 和PAMT 的增加，血管周圍炎癥細胞減少，說明葛根素在野百合堿模型中具有抑制肺動脈高壓形成過程中肺動脈重建和減輕肺血管周圍炎癥的作用。

總之，COPD 的病因復雜，且多因素相互影響，COPD 繼發肺動脈高壓的發病機制涉及功能性、解剖學因素以及血容量增多和血黏度增加等方面。炎癥細胞和相關的細胞因子網絡參與肺血管重建的機制日益受到重視，我們的實驗首次采用更符合COPD 肺動脈高壓炎性環境的野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠模型，發現肺動脈高壓時FKN 在血漿、肺組織和肺細小動脈內皮上表達增強，并且與肺動脈壁厚度的變化密切相關，葛根素有明顯的下調FKN 和緩解肺動脈高壓的作用。這可能有助于進一步闡明COPD 繼發肺動脈高壓的形成機制，同時也為葛根素在治療肺動脈高壓患者上的推廣應用提供實驗研究依據。

［1］ Viegi G，Scognamiglio A，Baldacci S，et al.Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD)［J］.Respiration，2001，68(1):4－19.

［2］ Voelkel NF，Tuder RM，Bridges J，et al. Interleukin－1 receptor antagonist treatment reduces pulmonary hypertension generated in rats by monocrotaline［J］. Am J Respir Cell Mol Biol，1994，11(6):664－675.

［3］ Kimura H，Kasahara Y，Kurosu K，et al. Alleviation of monocrotaline－induced pulmonary hypertension by antibodies to monocyte chemotactic and activating factor/monocyte chemoattractant protein－1［J］. Lab Invest，1998，78(5):571－581.

［4］ Libby P. Inflammation in atherosclerosis ［J］. Nature，2002，420 (6917):868－874.

［5］ Dorfmuller P，Zarka V，Durand－Gasselin I，et al. Chemokine RANTES in severe pulmonary arterial hypertension［J］. Am J Resp Crit Care Med，2002，165(4):534－539.

［6］ Haskell CA，Cleary MD，Charo IF. Molecular uncoupling of fractalkine－mediated cell adhesion and signal transduction. Rapid flow arrest of CX3CR1－expressing cells is independent of G－protein activation ［J］. J Biol Chem，1999，274(15):10053－10058.

［7］ Fong AM，Robinson LA，Steeber DA，et al. Fractalkine and CX3CR1 mediate a novel mechanism of leukocyte capture，firm adhesion，and activation under physiologic flow［J］. J Exp Med，1998，188(8):1413－1419.

［8］ Feng L，Chen S，Garcia GE，et al. Prevention of crescentic glomerulonephritis by immunoneutralization of the fractalkine receptor CX3CR1.Rapid communication［J］. Kidney Int，1999，56(2):612－620.

［9］ Bazan JF，Bacon KB，Hardiman G，et al. A new class of membrane－bound chemokine with a CX3C motif ［J］.Nature，1997，385(6617):640－644.

［10］ Hasegawa M，Sato S，Echigo T，et al. Up regulated expression of fractalkine/CX3CL1 and CX3CR1 in patients with systemic sclerosis ［J］. Ann Rheum Dis，2005，64(1):21－28.

［11］ Yajima N，Kasama T，Isozaki T，et al. Elevated levels of soluble fractalkine in active systemic lupus erythematosus:potential involvement in neuropsychiatric manifestations［J］. Arthritis Rheum，2005，52(6):1670－1675.

［12］ Matsunawa M，Odai T，Wakabayashi K，et al. Elevated serum levels of soluble CX3CL1 in patients with microscopic polyangiitis ［J］. Clin Exp Rheumatol，2009，27(1):72－78.

［13］ Matsunawa M，Isozaki T，Odai T，et al. Increased serum levels of soluble fractalkine (CX3CL1)correlate with disease activity in rheumatoid vasculitis ［J］. Arthritis Rheum，2006，54(11):3408－3416.

［14］ Bjerkeli V，Damas JK，Fevang B，et al. Increased expression of fractalkine (CX3CL1) and its receptor，CX3CR1，in Wegener's granulomatosis possible role in vascular inflammation ［J］. Rheumatology (Oxford)，2007，46(9):1422－1427.

［15］ Balabanian K，Foussat A，Dorfmuller P，et al. CX3C chemokine fractalkine in pulmonary arterial hypertension［J］.Am J Resp Crit Care Med，2002，165(10):1419－1425.

［16］ 陳秀芳，雷康福，董 敏，等.葛根素對糖尿病大鼠心肌損傷的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(4):650－655.

［17］ 婁海燕，魏欣冰，王汝霞，等. 葛根素對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后炎癥反應的抑制作用［J］. 中國病理生理雜志，2007，23(2):366－369.

［18］ 李繼武，季亢挺，范小芳，等.葛根素對慢性低氧高二氧化碳大鼠肺動脈高壓形成的預防作用［J］. 中國預防醫學雜志，2008，9(2):113－118.

［19］ 林 全，王良興，黃曉穎，等.葛根素對缺氧性大鼠肺組織骨橋蛋白及其整合素β3 受體基因表達的影響［J］.中國藥理學通報，2009，25 (7):887－890.