超臨界CO₂流體萃取巖白菜中巖白菜素的研究

　　摘要：目的：研究超臨界CO流體萃取巖白菜中巖白菜素的最佳工藝。方法：用紫外-可見分光光度計法測定巖白菜素的含量為指標，探討了萃取壓力、萃取溫度、乙醇濃度及用量等因素對巖白菜素收率的影響，確定超臨界CO萃取巖白菜中巖白菜素的最佳條件。結果：在萃取壓力為15MPa，萃取溫度為55℃，分離壓力為6MPa，分離溫度為40℃，乙醇的濃度為70%的條件下所得提取物中巖白菜素的含量最高。結論：在提取的最佳參數組合下，提取物中巖白菜素的含量達12.4%，該工藝條件適宜巖白菜素的提取。
　　關鍵詞：巖白菜；巖白菜素；超臨界二氧化碳萃取
　　中圖分類號：R284.2文獻標識碼：A
　　文章編號：1007-2349（2011）03-0060-03
　　巖白菜為虎耳草科巖白菜屬植物巖白菜Bergamapurpurascens（Hook.f.etThoms.）Engl.的干燥根莖，其主要有效成分巖白菜素屬于異香豆精類化合物，具有良好的鎮咳、祛痰、抗炎、護肝、抗病毒和神經保護等作用，現已廣泛應用于臨床，主要用于慢性支氣管炎的治療［1］。
　　超臨界萃取技術［2~3］是一種集提取和分離為一體，又基本上不用有機溶劑的新技術。近20年來的研究表明［4~5］超臨界萃取技術的自身優勢主要有：萃取能力強，提取率高；操作溫度低，能較完好地保存中藥有效成分不被破壞，不發生次生化，適合那些對熱敏感性強、容易氧化分解破壞的成分的提取；CO超臨界流體對物質溶解作用有一定的選擇性，除與目標物的極性、沸點、分子量等因素密切相關外，還與超臨界萃取時的溫度、壓力、夾帶劑等關系密切。本實驗就溫度、壓力及夾帶劑對萃取巖白菜中巖白菜素的影響進行了初步研究。
　　1儀器與試藥
　　1.1儀器超臨界CO萃取設備（型號：HA221-50-06，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）；紫外-可見分光光度儀（型號：UV-2450，日本島津）；電子分析天平（型號：PercisaXS-125A，瑞士產）；旋轉蒸發儀（型號：BUCHI-R-200，瑞士產）等。
　　1.2試藥甲醇、乙醇（均為分析純），水（去離子水），D-101大孔吸附樹脂（天津農藥股份有限公司樹脂分公司生產），CO氣體（昆明氧氣廠，食品級純度≥99.9%）。巖白菜樣品（同一批次）由本院楊樹德副教授鑒定為虎耳草科巖白菜屬植物巖白菜Bergamapurpurascens（Hook.f.etThoms.）Engl.的干燥根莖，粉碎備用。巖白菜素對照品（供含量測定用，批號：111532—200202）購于中國藥品生物制品檢定所。
　　2方法與結果
　　2.1標準曲線的建立稱量適量巖白菜素對照品置于容量瓶中，加甲醇溶解，以甲醇為空白，在200～800nm波長段掃描，結果顯示巖白菜素在274nm處有最大吸收，故選274nm作為巖白菜素的測定波長。如圖1所示。
　　2.1.1對照品溶液的配制精密稱量3.0mg巖白菜素對照品置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，得到60μg/mL的巖白菜素對照品溶液。
　　2.1.2巖白菜超臨界CO提取率測定
　　取巖白菜超臨界CO提取物1g用蒸餾水10mL溶解后轉移至大孔吸附樹脂柱中，靜置30min后用300mL去離子水洗脫，棄去水洗部分，再用20%乙醇洗脫，收集洗脫液300mL，取洗脫液0.1mL置10mL容量瓶中稀釋搖勻，并定容至刻度，待測。目標成分的提取率按下面的公式計算。
　　式中P表示提取率（%），C表示濃度（μg/mL），A表示吸收值，n表示提取液的稀釋倍數，V表示提取液的體積（mL），W表示巖白菜原料投料量（g）。
　　2.1.3標準曲線的制備精密量取60μg/mL的巖白菜素對照品溶液1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、5.5mL分別置10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。分別以甲醇為空白對照（如圖1所示），在274nm波長處測定吸收度。以縱坐標作為吸收度，以橫坐標作為濃度，制定標準曲線，得到標準曲線為y=0.02267c-0.00445（r=0.99986）。如圖2所示，結果表明巖白菜素對照品在9.0～33.0μg/mL范圍內線性關系良好。
　　2.2精密度試驗取同一濃度巖白菜素對照品溶液連續測定5次，測定結果見表1所示。結果：RSD=0.202%，表明儀器精密度良好。
　　2.3穩定性試驗分別取同一濃度對照品溶液和供試品溶液在0、0.5、1、2、4h時測定濃度，測定結果見表2，結果表明在4h內溶液穩定。
　　2.4加樣回收率取已知濃度萃取物（A：含巖白菜素量）5份，分別精密加入一定量巖白菜素對照品（B），并溶解定容于10mL，適當稀釋（取0.1mL置10mL容量瓶中加適量甲醇溶解，定溶至刻度，測定含量，結果顯示加樣回收率較好。見表3。
　　3結果
　　3.1單因素下巖白菜素萃取條件研究
　　3.1.1萃取壓力對巖白菜中巖白菜素提取率的影響分別選取壓力為：10、15、20、25、30MPa。其他因素設定為：萃取溫度45℃，80%乙醇用量300mL，萃取時間1.0h，CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃。分別進行實驗，按2.1.3的純化方法及公式計算巖白菜素的萃取率。見圖3。
　　由圖3可以看出，萃取壓力在10～15MPa之間時，提取率隨著萃取壓力的增加而顯著提高，在15MPa時有最佳得率。超過15MPa后，萃取率逐漸下降。但20MPa時巖白菜素的萃取率比10MPa時高，可以看出選用萃取壓力在10～20MPa進行萃取較為合適。
　　3.1.2萃取壓力對巖白菜中巖白菜素提取率的影響分別設定溫度為：40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。其他因素設定為：萃取壓力15MPa，80%乙醇用量300mL，萃取時間1.0h，CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃。分別進行實驗，按2.1.3的純化方法及公式計算出巖白菜素的萃取率。結果見圖4。
　　圖4萃取溫度對巖白菜素提取率的影響[KH*3]
　　由圖4可以看出，在55℃時萃取效果最佳，但溫度過高可能使流體的密度發生改變，使被萃取物在其中的溶解度下降，從而使得率減少。因此本實驗選用萃取溫度范圍為50～60℃安排正交。
　　3.1.3乙醇濃度對巖白菜素提取率的影響根據設備條件及預實驗，分別選取乙醇濃度為：60%、70%、80%、90%、100%。其他因素設定為：萃取壓力15MPa，萃取溫度55℃，乙醇用量300mL，萃取時間1.0h，CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃分別進行實驗，按2.1.3的純化方法及公式計算巖白菜素的萃取率。結果見圖5。
　　由圖5可以看出，在70%乙醇濃度時萃取效果最佳，但過高或過低都會使得率減少。因此本實驗選用乙醇濃度為65%～75%進行正交設計。
　　3.1.4乙醇用量對巖白菜素萃取率的影響分別選取乙醇用量為：100、200、300、400、500、600mL。其他因素設定為：萃取壓力15MPa，萃取溫度55℃，70%乙醇為夾帶劑，萃取時間1.0h，CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃分別進行實驗，按2.1.3的純化方法及公式計算巖白菜素的萃取率。結果見圖6。
　　
　　由圖6可以看出，在100~500mL范圍內，增加夾帶劑乙醇用量可以使得率明顯增加，當乙醇用量多于500mL后，萃取效果逐漸不明顯。考慮提取成本及設備自身原因，也不宜過多使用夾帶劑，因此固定乙醇用量為500mL進行實驗。
　　3.2正交試驗在單因素試驗的基礎上，固定CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃，乙醇用量500mL及萃取時間1h等5個因素，選取萃取壓力，萃取溫度及乙醇濃度3個因素為變量，每個因素取3個水平進行正交設計，因素水平表見表4，L9（34）正交試驗結果見表5，方差分析見表6。
　　由巖白菜素提取率的正交試驗直觀分析可以得知，因素的影響順序為：乙醇濃度>2N3xt6dAzYzYbEWpO++LAA==萃取溫度>萃取壓力。巖白菜較佳的提取工藝組合為：ABC，即濃度為70％的乙醇為夾帶劑，萃取壓力15MPa，萃取溫度55℃。
　　3.3優選工藝的驗證實驗為進一步考察上述優選工藝的可行性，按上述最佳工藝條件進行驗證實驗，巖白菜素的含量分別為：12.2%，12.4%，12.5%，12.4%，12.7%，平均得率為12.4%，證明該工藝可行。
　　4討論
　　未見采用超臨界二氧化碳流體技術直接從巖白菜藥材中萃取巖白菜素的報道，相關文獻［6］也只對萃取結晶巖白菜素進行了研究，本研究采用超臨界CO流體萃取技術直接萃取巖白菜中巖白菜素，并通過單因素試驗、正交試驗得出最佳萃取條件為：萃取壓力為15MPa，乙醇濃度為70%，萃取溫度為55℃，其它條件為固定CO流量20L/h，分離壓力6MPa，分離溫度35℃，乙醇用量500mL及萃取時間1h，巖白菜素的提取率經紫外測定可達12.4%，較為理想。
　　本研究為民族藥材巖白菜再次開發利用及提高相關制劑質量提供了一定的參考和幫助。
　　參考文獻：
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　　（收稿日期：2010-12-06）