來氟米特對膠原性關節炎大鼠CD4⁺CD25⁺調節性T細胞的影響

摘 要 目的：探討來氟米特對膠原性關節炎中免疫抑制性CD4+CD25+調節性T細胞的作用。方法：II型膠原誘導Wistar大鼠，建立膠原性關節炎模型；檢測關節炎大鼠多發性關節炎評分，每周2次；流式細胞儀檢測脾淋巴細胞中CD4+CD25+調節性T細胞的比例；RT-PCR檢測脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達。結果：與模型組比較，來氟米特（2 mg/kg，灌胃給藥15 d）明顯降低CIA大鼠多發性關節炎評分。與關節炎模型組比較，藥物干預組CD4+CD25+調節性T細胞的比例升高，轉錄因子Foxp3 mRNA的表達增高。結論：來氟米特具有抑制關節炎大鼠關節腫脹的作用，該作用可能和促進CD4+CD25+Treg產生和增加Foxp3的表達有關。

關鍵詞關節炎 來氟米特 CD25

中圖分類號：R392.5 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533(2011)11-0548-03

Effect of leflunomide on CD4+CD25+ regulatory T cells in collagen-induced arthritis rats*

WANG Ting-yu1，LI Jun2，JIN Zhi-gui1，WU Fei-hua1，JIN Jian1，TANG Ting-ting3，4

（1. Department of Pharmacy，Shanghai Ninth People’ s Hospital，School of Medicine at Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200011；2. School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei，230032；3. Shanghai Key Laboratory of Orthopaedic Implant，Shanghai，200011；4. Department of Orthopaedic Surgery，Shanghai Ninth People’ s Hospital，School of Medicine at Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200011）

ABSTRACTObjective: To investigate the effect of leflunomide on the immunosuppressive CD4+CD25+ regulatory T cells (CD4+CD25+ Tregs) in collagen-induced arthritis (CIA). Methods: CIA was induced by collagen type II in Wistar rats. Polyarthritis indexes were checked twice a week. Immunofluorescence flow cytometry and RT-PCR were used to determine the proportion of CD4+CD25+ Tregs and the expression of Foxp3 mRNA in the splenocytes of CIA rats，respectively. Results: Leflunomide (2 mg/kg，ig×15 days，day 10-24) could significantly decrease the polyarthritis indexes in CIA rats. Compared with model CIA rats，administration of leflunomide could significantly increase the number ofCD4+CD25+ Tregs and the expression of Foxp3 mRNA in spleen lymphocytes of CIA rats. Conclusions: The results demonstrated that the inhibition of arthritis by leflunomide was related to changes in CD4+CD25+ Tregs.

KEY WORDSarthritis；leflunomide；CD25

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis， RA）存在著持續性滑膜炎癥及進展性軟骨和骨破壞，是一種炎性、自身免疫性疾病。來氟米特是一種疾病調修藥物，廣泛應用于RA的治療[1]。動物實驗研究表明，來氟米特能抑制足趾腫脹和關節破壞[2]。臨床研究發現，來氟米特能夠延緩RA疾病進展、改善患者的癥狀、提高患者的生活質量[1]。

CD4+CD25+調節性T細胞(CD4+CD25+ regulatory T cells， CD4+CD25+Tregs)是一種免疫抑制性T細胞，其表面高表達CD25（IL -2Rα），占外周血CD4+ T細胞的5%~10％[3]。大量動物實驗結果證實，CD4+CD25+Tregs在維持自身免疫耐受和預防自身免疫性疾病中起著關鍵作用[4]。轉錄因子Foxp3特異性表達于CD4+CD25+ Tregs[5]，使之區別于活化的CD4+ T細胞。Foxp3的表達對于CD4+CD25+Tregs的產生和功能維持是必要的，是CD4+CD25+Tregs的特異性標志物之一。

鑒于來氟米特的免疫抑制性和CD4+CD25+Tregs的重要作用，本文將研究來氟米特對膠原性關節炎大鼠CD4+CD25+Tregs的影響，探討來氟米特是否通過上調CIA大鼠體內的CD4+CD25+Tregs、從而抑制大鼠體內過度增殖的T淋巴細胞并最終抑制關節炎癥的。

1材料和方法

1.1主要藥物及試劑

來氟米特由美國欣凱公司上海代表處提供；II型膠原（CII）、弗氏不完全佐劑（IFA）購于Sigma公司；小鼠抗大鼠FITC-CD4抗體、小鼠抗大鼠PE-CD25抗體及同型對照購于Caltag公司；Trizol reagent購于Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購于Promega公司。

1.2膠原性關節炎大鼠模型的建立

Wistar大鼠30只，體重(110±20) g，隨機分成正常組、CIA模型組和來氟米特用藥組。將CII溶入0.1 mol/L的乙酸中配成2 g/L，4 ℃攪拌過夜，與等體積IFA混合，充分乳化。將乳劑0.5 ml分多點注射至大鼠背部皮內，1周后同法繼續注射。正常組大鼠注射等量生理鹽水。第10~24天，用藥組灌胃給予2 mg/kg來氟米特，正常組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.3藥效學評價

采用多發性關節炎指數評價來氟米特對CIA大鼠的治療作用。

1.4CD4+CD25+ T細胞的檢測

致炎后第35天，股動脈放血處死大鼠，無菌制備大鼠脾淋巴細胞懸液（1×106/ml），加入FITC-CD4和PE-CD25抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌后上流式細胞儀檢測，計算CD4+CD25+ T細胞占CD4+ T細胞的比例。

1.5Foxp3 mRNA的檢測

采用Trizol 法提取脾淋巴細胞總RNA，AMV 逆轉錄酶逆轉錄得到cDNA。PCR引物委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

Foxp3上游：5’ - TAATATGCGGCCCCCTTTCACCTA -3’；Foxp3下游：5’ - GGCCCCCGTCCATGTTTTCTTG -3’。

β-actin上游：5’ - GATATCGCTGCGCTCGTCGTC -3’；β-actin下游：5’ - GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG -3’。

PCR擴增35個循環，PCR 產物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.6統計學處理

計量資料數據以x±SEM表示，組間比較采用SPSS 13.0統計軟件中One-Way ANOVA分析。P＜0.05為有統計學差異。

2結果

2.1來氟米特對CIA大鼠多發性關節炎評分的影響

與正常組比較，CIA模型組大鼠造模10 d后大鼠關節腫脹度顯著增加，肢體持續紅腫，逐漸出現關節畸形。來氟米特（2 mg/kg）可明顯抑制CIA大鼠多發性關節炎指數（表1）。

2.2來氟米特對CIA大鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+ T細胞的影響

結果如圖1所示，與正常組相比，CIA組CD4+CD25+ T細胞的比例明顯降低。來氟米特能明顯提高CIA大鼠CD4+CD25+ T細胞的比例。

2.3來氟米特對CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA表達的影響

與正常組相比，CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達明顯降低，來氟米特可明顯提高CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達（圖2）。

3討論

疾病調修藥來氟米特在臨床上被廣泛用于類風濕性關節炎的治療，其作用機制可能與抑制淋巴細胞的活性有關[6]，但是具體機制未明。本文選取多發性關節炎指數進行評估，結果表明來氟米特能明顯減少CIA大鼠的多發性關節炎評分，說明來氟米特對CIA大鼠的多發性關節炎具有治療作用。

近年來研究發現，CD4+CD25+Tregs對自身反應性T細胞的抑制作用在維持自身免疫耐受中起著關鍵作用。Gonzalez-Rey 等[7]發現，血管活性腸肽治療CIA與其促進CD4+CD25+Tregs的產生有關，清除小鼠體內的CD4+CD25+Tregs有利于關節炎的形成[8]?？筎NF-α抗體通過抑制炎癥上調功能性CD4+CD25+Tregs[9]。本文中，我們發現CIA大鼠體內CD4+CD25+Tregs數量降低。CD4+CD25+Tregs數量不足，引起CD4+CD25+Tregs的免疫抑制功能不足，導致CIA大鼠體內Th1細胞所致的免疫反應作用增強，最終致使CIA大鼠體內免疫功能失調，關節炎癥持續存在。來氟米特灌胃給予CIA大鼠后能明顯提高CIA大鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+ T細胞的比例。來氟米特治療CIA可能與其提高CIA大鼠CD4+CD25+Tregs的數量有關。

Foxp3基因最初是在Scurfy小鼠中發現的，小鼠Foxp3基因位于染色體XA1.1，全長30 858 bp，編碼蛋白含431個氨基酸。人Foxp3基因位于染色體Xp11.23，有11個外顯子，編碼一個48 kD的蛋白Scurfin。轉錄因子Foxp3選擇性表達于CD4+CD25+Tregs，是CD4+CD25+Tregs的高度特異性標記，直接參與CD4+CD25+Tregs的發育和功能維持。在CD4+CD25- T細胞中異位表達Foxp3能使其具有CD4+CD25+Tregs的表型和功能[10]。Valencia等[11]研究發現，給予RA患者抗TNF-α抗體治療后，患者CD4+CD25+Tregs中Foxp3 mRNA和蛋白的表達水平均提高，同時伴隨著CD4+CD25+Tregs抑制功能的提高。更重要的是，CD4+ T細胞活化后并不能誘導Foxp3的表達。因此，檢測Foxp3的水平能較真實地反映CD4+CD25+Tregs的水平和功能，是目前公認的反映CD4+CD25+Tregs的“金標準”。我們用RT-PCR法檢測脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達水平。結果表明，CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達明顯低于正常大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達。這與前面流式細胞術分析的脾淋巴細胞中CD4+CD25+ T細胞的比例結果是一致的，說明CIA大鼠體內CD4+CD25+Tregs的數量和功能均較正常大鼠降低。重要的是，給予CIA大鼠來氟米特治療后，其脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA的表達顯著升高，同時伴隨著CD4+CD25+Tregs的數量提高。提示來氟米特能明顯提高CIA大鼠體內CD4+CD25+Tregs的數量和功能，這可能是來氟米特治療CIA的新的作用機制。

參考文獻

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（收稿日期：2011-08-05）