LC-MS/MS法分析人體內25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D₃濃度的系統綜述

摘要人體系統循環中的25-羥基維生素D2（25(OH)D2）和25-羥基維生素D3（25(OH)D3）濃度反映著人體內的維生素D狀態。本綜述旨在對使用LC-MS/MS法分析人體內25(OH)D濃度的方法進行全面的綜述和評價。通過搜索數據庫共篩選到20篇相關文獻，發現同位素內標的選擇、質譜離子源、衍生化、母離子的選擇、基質效應和干擾物分離等因素會影響分析的準確度和靈敏度。為了建立一個靈敏和準確的分析方法，需要對上述影響因素進行優化。

關鍵詞25-羥基維生素D2 25-羥基維生素D3 LC-MS/MS法 同位素內標 基質效應

中圖分類號：O657；Q565 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533(2011)10-0477-04

1維生素D的生理效應及體內特點

維生素D是一個脂溶性維生素，在維持人體內鈣的動態平衡方面起著非常重要的作用，能和鈣一起促進兒童骨骼的形成和維持成人骨骼的強度。在兒童中，維生素D的缺乏會導致骨骼畸形，如出現佝僂病等；而在成人中，維生素D的缺乏會導致骨質疏松癥[1]。最近有研究證實，血清中維生素D濃度高與較低的乳腺癌、結腸癌和前列腺癌的發生率有顯著的相關性[2]。維生素D缺乏也可能是一個潛在的心血管疾病危險因素[3]。

維生素D主要存在兩種形式，分別為維生素D2和維生素D3。對絕大部分人來講，人體在陽光照射下皮膚中形成維生素D是維生素D3的主要來源，而維生素D2主要存在于各種食物和植物中。這兩種維生素D都會在肝臟中被代謝形成25-羥基維生素D（25(OH)D），然后在腎臟中進一步被代謝形成1，25-二羥基維生素D（1，25(OH)2D）[1]。維生素D及其代謝產物主要和血中的維生素D結合蛋白結合，只有0.03%的25(OH)D是以游離形式存在的[1]。由于維生素D和1，25(OH)2D的半衰期相對較短（＜2 d），故系統循環中的25(OH)D被認為是反映人體內維生素D水平的重要指標[1， 4]。人血清中正常的25(OH)D濃度約為10～50 ng/ml，而高濃度的25(OH)D（＞200 ng/ml）可能與毒性和不良的健康狀況有關[5]。

2分析25(OH)D的方法

目前有很多不同的分析技術和方法可用于分析人體內的25(OH)D濃度，其中酶免疫分析法曾經是檢測血清中25(OH)D濃度的最主要方法，且至今仍在被廣泛應用[6]。酶免疫分析法的主要缺陷是抗體之間的交叉反應導致的方法特異性不足，而色譜分析法可對這些分析物進行有效分離，從而獲得足夠的特異性。在這一方面，液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）法有很大的優勢。由于LC-MS/MS法的高選擇性、特異性和靈敏度，目前該分析技術已越來越廣泛地用于臨床檢驗實驗室中對25(OH)D的分析。

3LC-MS/MS法分析人體內25(OH)D的研究現狀

鑒于LC-MS/MS法在分析25(OH)D2和25(OH)D3時的獨特優勢，對近10年內發表的相關英文文獻進行搜索，發現采用LC-MS/MS法分析人體內25(OH)D的研究在最近兩年內有顯著增長。筆者共獲得20篇相關英文文獻[7~26]，下面就LC-MS/MS法分析人體內25(OH)D的研究作一全面的系統綜述和評價，并對影響檢測靈敏度和準確度的關鍵影響因素進行分析。

3.1針對不同人體生物樣品的LC-MS/MS法分析策略

大部分研究分析的生物樣品均是人血清或血漿，但是有一項研究的分析樣品是人的唾液[9]。人唾液中25(OH)D2或25(OH)D3的濃度顯著低于血清中的濃度，故對分析的靈敏度提出了更高的要求。這項研究實際上是目前已經報道的最靈敏的分析方法，柱上絕對靈敏度達到了0.7 pg。為了獲得高靈敏度，這項研究使用了Cookson試劑（4位取代的1，2，3-三唑啉-3，5-二酮）對25(OH)D進行衍生化反應。25(OH)D2或25(OH)D3本身在電噴霧電離（ESI）下很難被電離，而通過衍生化反應加上一個含豐富N原子的基團后，這一含N基團會使衍生化產物在正離子ESI下很容易形成加氫峰[M+H]+，從而大大提高分析的靈敏度（提高達100倍）。在此基礎上，該研究又通過在流動相中加入少量甲胺，使得衍生化產物形成甲胺加合離子[M+CH3NH3]+，后者的形成降低了加氫峰和脫水產物的離子強度，進一步提高了分析的靈敏度。但該研究的樣品處理過于復雜。另有兩項研究分析的樣品是人的干血點[10， 15]。干血點法（DBS）的主要優點是用血量少（如只需3.28 μl全血）、樣品容易保存和運輸，但對分析的要求也很高。為了保證分析的靈敏度，這兩項研究同樣采用了衍生化的樣品處理方法。

3.2對于提高LC-MS/MS法分析準確度的研究現狀及存在問題

從不同研究的內標選擇來看，大部分研究使用了同位素內標，但是有5項研究沒有使用同位素內標[7~11]。這些研究所選擇的內標均為25(OH)D的結構類似物，同時這些研究還均沒有考察基質效應。因此，這些研究的分析準確性可能受基質效應的影響。雖然大部分研究使用了同位素內標，但是其中有6項研究[12~15， 17， 24]僅使用了單個同位素內標。僅使用一個同位素內標不能滿足兩個或兩個以上待測物的分析需求。其它研究均使用了多個同位素內標，每個待測物對應一個同位素內標。

在ESI源中，基質效應是一個必須要考慮的問題，而在大氣壓化學電離（APCI）或大氣壓光致電離（APPI）源中一般不存在顯著的基質效應。在13項使用ESI源的研究中只有4項研究對基質效應進行了考察[18， 19， 23， 25]，在未考察基質效應的9項研究中有4項研究沒有使用同位素內標[8~11]，另有4項研究只使用了單個同位素內標分析兩個待分析物[13， 15， 17， 24]。這說明在分析人的生物樣品中25(OH)D2和25(OH)D3的濃度時，絕大部分研究都忽視了對ESI源的基質效應的考察，很可能會對分析方法的準確性產生一定程度的影響。

在所有20項研究中，只有6項研究考察了內源性的同分異構體對25(OH)D3的分析干擾[10， 11， 13， 14， 23， 26]，且這6項研究中只有兩項研究的考察比較系統和全面[11， 23]。這兩項研究均采用了較為復雜的二維液相色譜進行分離，從而大大提高了分析物和干擾物之間的分離效果。目前已知能夠干擾25(OH)D3分析的內源性成分主要是1α-羥基維生素D3、3-表-25(OH)D3和7α-羥基-4-膽甾烯-3-酮。總體來看，對內源性干擾物的研究現狀不能令人滿意，大部分研究均忽視了對干擾物的色譜分離，很可能會影響分析結果的準確性。

質譜儀的選擇對分析準確度也有一定的影響，除了一項研究使用離子阱質譜儀外[7]，其它研究均選擇了串聯四級桿質譜儀或串聯四級桿線性離子阱質譜儀。選擇普通離子阱質譜儀對25(OH)D2或25(OH)D3進行定量分析是不合適的，會影響分析的準確度和可靠性。

3.3對于提高LC-MS/MS分析靈敏度的研究現狀及存在問題

為了獲得較好的分離度和靈敏度，共有6項研究使用了超高效液相色譜儀[11， 16~18， 23， 24]，有一項研究為了進一步提高靈敏度甚至使用了毛細管微流液相色譜儀。毛細管微流液相色譜儀的流速單位通常是μl/min，低流速可以大大降低對樣品的稀釋程度，從而提高質譜檢測的靈敏度。毛細管微流液相色譜法的主要局限性是樣品載荷能力有限，故對樣品的前處理要求很高，在樣品前處理時需要最大程度地去除樣品干擾基質。其它研究均采用了普通的高效液相色譜儀。

對離子源，在不同的分析條件下需要進行不同的選擇。比如，有的研究為了提高分析靈敏度進行了衍生化反應，而衍生化產物在正離子ESI下具有很好的質譜響應，故凡涉及到衍生化處理的分析方法均采用了正離子ESI進行質譜檢測。在沒有采用衍生化的分析方法（12項研究）中，有的采用ESI模式（6項研究），有的選擇了APCI模式（4項研究）或APPI模式（2項研究）。總的來說，ESI和APCI（或APPI）兩種模式下的分析靈敏度似乎差別不大。但需注意的是，APPI下的分析靈敏度要顯著高于APCI下的靈敏度[21， 22]。因此，如要建立一個不需衍生化的簡單的分析方法，建議選擇APPI源進行檢測。

在不同類型的檢測模式下（ESI或APCI），所選擇的流動相中的電解質種類也不同。在ESI模式下，為了讓分析物形成[M+H]+或[M+CH3NH3]+，一般在流動相中加入0.1%的甲酸或5 mM的甲胺；而在APCI或APPI模式下，一般不在流動相中添加任何電解質，但有兩項研究分別在流動相中添加了甲酸（10 mM）和甲苯（1%）[22， 23]。需指出的是，使用甲苯作為流動相添加劑的研究使用了APPI電離模式，該研究發現在流動相中添加甲苯能顯著提高分析的靈敏度。

為了提高分析的靈敏度，總共20項研究中有8項研究使用了柱前衍生化的方法[7， 9， 10， 15， 16， 18， 19， 25]。對所有20項研究的靈敏度從高到低進行排序后發現，靈敏度最高的6項研究均采用了衍生化的方法，說明衍生化方法能顯著提高分析的靈敏度[9， 10， 15， 16， 18， 19]。衍生化試劑均采用Cookson試劑，而25(OH)D2和25(OH)D3的衍生化產物均存在6S和6R兩種構型。為了滿足分析的準確性的要求，必須對這兩種同分異構體進行色譜分離。有的研究對這兩種同分異構體進行了色譜分離[16]，但也有研究對這兩種物質的分離效果不是很理想、至少沒有達到基線分離[15]。8項使用衍生化反應的研究中有6項使用了4-苯基-1，2，3-三唑啉-3，5-二酮（PTAD）。需指出的是，有一項研究的衍生化反應是分兩步進行的：第一步使用PTAD進行Diels–Alder反應，第二步對3位上的羥基進行乙酰化反應[10]。進行乙酰化反應的目的是為了對25(OH)D3和3-表-25(OH)D3進行更好的色譜分離。3-表-25(OH)D3是25(OH)D3的同分異構體，會干擾25(OH)D3的準確定量。

檢測母離子的選擇同樣會影響分析靈敏度。在非衍生化的分析方法中，除了一項研究選擇加氫脫水峰[M-H2O+H]+作為母離子進行檢測外[21]，其它研究均選擇[M+H]+作為母離子進行檢測。這說明在非衍生化條件下，25(OH)D2或25(OH)D3在ESI源中主要形成的是[M+H]+。而在衍生化的8項研究中，有4項研究選擇了[M-H2O+H]+作為母離子進行檢測[15， 16， 19， 25]，其它3項研究為了提高分析靈敏度，在流動相中添加了一定量的甲胺[9， 10， 18]，使得分析物形成響應較高的[M+CH3NH3]+。

3.4生物樣品的前處理方法

對于生物樣品的前處理，絕大部分研究的前處理方法均比較復雜，一般程序是：1）用甲醇、乙腈或其它有機試劑對血樣進行蛋白沉淀，將與蛋白結合的25(OH)D釋放出來。有一項研究在蛋白沉淀前專門使用了氫氧化鈉來釋放與蛋白結合的25(OH)D[24]，但此似無必要。2）采用液-液萃取或固相萃取法提取25(OH)D。有的研究在這一步采用了在線自動固相萃取法。3）有的研究會進行衍生化處理。4）濃縮和復溶。有3項研究采用了非常簡便的樣品處理方法，這些研究均在采用乙腈或丙酮沉淀蛋白后直接進行分析或濃縮后分析[20~22]，且分析方法的靈敏度能夠滿足分析人血清中25(OH)D的要求。必須指出的是，這三項研究均采用了APCI或APPI模式，同時選擇的質譜儀也是較新一代的質譜儀，如API 4000、API 5000或Agilent 6460。

4結論

為了建立一個高靈敏度的人血清中25(OH)D2和25(OH)D3的LC-MS/MS分析方法，最好選擇衍生化的樣品處理方法，并選擇正離子ESI源檢測[M+CH3NH3]+（流動相添加甲胺）或[M-H2O+H]+（流動相添加甲酸）作為母離子。為了提高分析的準確性，必須對所有可能的內源性干擾物和分析物25(OH)D進行色譜分離，每個待分析物都要有相應的同位素內標，對基質效應也必須進行系統的考察。如果發現有基質效應，應采取措施予于克服。如要建立一個簡便的分析方法（沉淀蛋白后直接進樣分析而不進行衍生化反應），應選擇較新一代的串聯四級桿質譜儀，再結合使用APPI源檢測[M+H]+（流動相不添加電解質）作為母離子，可以滿足對人血清中25(OH)D的分析需求。

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（收稿日期：2011-08-12）